如何快速?gòu)幕蚪M中提取基因、轉(zhuǎn)錄本、蛋白、啟動(dòng)子、非編碼序列？
NGS基礎(chǔ) - GTF/GFF文件格式解讀和轉(zhuǎn)換這篇文章有讀者留言想要提取外顯子，內(nèi)含子，啟動(dòng)子，基因體，非編碼區(qū)，編碼區(qū)，TSS上游1500,TSS下游500的序列。下面我們就來(lái)示范如何提取這些序列。
NGS基礎(chǔ) - 參考基因組和基因注釋文件提到了如何下載對(duì)應(yīng)的基因組序列和基因注釋文件。
假如我們已經(jīng)拿到了基因組序列文件GRCh38.fa和基因注釋文件GRCh38.gtf，也可從文后鏈接獲取。
查看下文件內(nèi)容和格式
基因組序列文件為FASTA格式，查看命令和內(nèi)容如下（測(cè)試文件，只有1條染色體）：
# 查看前10行，每行查看前40個(gè)字符
# FASTA序列一般比較長(zhǎng)，查看前面一部分字符是一個(gè)常用的方式
head GRCh38.fa | cut -c 1-40
>chr20
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN基因注釋文件為GTF格式，只看前6列信息(第三列包含了不同的元件注釋）
cut -f 1-6 GRCh38.gtf | head
chr20 ensembl_havana gene 87250 97094 .
chr20 havana transcript 87250 97094 .
chr20 havana exon 87250 87359 .
chr20 havana exon 96005 97094 .
chr20 ensembl_havana transcript 87710 96533 .
chr20 ensembl_havana exon 87710 87767 .
chr20 ensembl_havana CDS 87710 87767 .
chr20 ensembl_havana start_codon 87710 87712 .
chr20 ensembl_havana exon 96005 96533 .
chr20 ensembl_havana CDS 96005 96414 .安裝提取工具gffread
這里用到了gffread (https://github.com/gpertea/gffread)，安裝方式如下 (若不理解，見(jiàn)這個(gè)為生信學(xué)習(xí)打造的開(kāi)源Linux教程真香的軟件安裝部分)：
git clone https://github.com/gpertea/gffread
cd gffread
make release提取轉(zhuǎn)錄本序列、CDS和蛋白序列
gffread -h可以參考所有可用參數(shù)，如果有特殊情況需要考慮的，還需配合其它參數(shù)使用。
1.獲取轉(zhuǎn)錄本序列
gffread GRCh38.gtf -g GRCh38.fa -w GRCh38.transcripts.fa內(nèi)容如下：
head GRCh38.transcripts.fa
>ENST00000608838
ACAGGAATTCATATCGGGGTGATCACTCAGAAGAAAAGGTGAATACCGGATGTTGTAAGCTATTGAACTG
CCACAAGTGATATCTTTACACACCATTCTGCTGTCATTGGGTAGCTTTGAACCCCAAAAATGTTGGAAGA
ATAATGTAGGACATTGCAGAAGACGATGTTTAGATACTGAAAGGTACATACTTCTTTGTAGGAACAAGCT
ATCATGCTGCATTTCTATAATATCACATGAATATACTCGACGACCAGCATTTCCTGTGATTCACCTAGAG2.獲取CDS序列
# 獲取CDS序列
gffread GRCh38.gtf -g GRCh38.fa -x GRCh38.cds.fa內(nèi)容如下
head GRCh38.cds.fa
>ENST00000382410
ATGAATATCCTGATGCTGACCTTCATTATCTGTGGGTTGCTAACTCGGGTGACCAAAGGTAGCTTTGAAC
CCCAAAAATGTTGGAAGAATAATGTAGGACATTGCAGAAGACGATGTTTAGATACTGAAAGGTACATACT
TCTTTGTAGGAACAAGCTATCATGCTGCATTTCTATAATATCACATGAATATACTCGACGACCAGCATTT
CCTGTGATTCACCTAGAGGATATAACATTGGATTATAGTGATGTGGACTCTTTTACTGGTTCCCCAGTAT
CTATGTTGAATGATCTGATAACATTTGACACAACTAAATTTGGAGAAACCATGACACCTGAGACCAATAC
TCCTGAGACTACTATGCCACCATCTGAGGCCACTACTCCCGAGACTACTATGCCACCATCTGAGACTGCT
ACTTCCGAGACTATGCCACCACCTTCTCAGACAGCTCTTACTCATAATTAA
>ENST00000382398
ATGAAGTCCCTACTGTTCACCCTTGCAGTTTTTATGCTCCTGGCCCAATTGGTCTCAGGTAATTGGTATG3.獲取蛋白序列
# 獲取蛋白序列
gffread GRCh38.gtf -g GRCh38.fa -y GRCh38.protein.fa內(nèi)容如下
head GRCh38.protein.fa
>ENST00000382410
MNILMLTFIICGLLTRVTKGSFEPQKCWKNNVGHCRRRCLDTERYILLCRNKLSCCISIISHEYTRRPAF
PVIHLEDITLDYSDVDSFTGSPVSMLNDLITFDTTKFGETMTPETNTPETTMPPSEATTPETTMPPSETA
TSETMPPPSQTALTHN
>ENST00000382398
MKSLLFTLAVFMLLAQLVSGNWYVKKCLNDVGICKKKCKPEEMHVKNGWAMCGKQRDCCVPADRRANYPV
FCVQTKTTRISTVTATTATTTLMMTTASMSSMAPTPVSPTG
>ENST00000382388
MGLFMIIAILLFQKPTVTEQLKKCWNNYVQGHCRKICRVNEVPEALCENGRYCCLNIKELEACKKITKPP
RPKPATLALTLQDYVTIIENFPSLKTQST解析GTF文件的結(jié)構(gòu)
針對(duì)本GTF，對(duì)于gene元件，基因名字 (Gene symbol)在第14列。
head -n 1 GRCh38.gtf | sed 's/"/\t/g' | tr '\t' '\n' | sed = | sed 'N;s/\n/\t/'
1 chr20
2 ensembl_havana
3 gene
4 87250
5 97094
6 .
7 +
8 .
9 gene_id
10 ENSG00000178591
11 ; gene_version
12 6
13 ; gene_name
14 DEFB125
15 ; gene_source
16 ensembl_havana
17 ; gene_biotype
18 protein_coding
19 ;針對(duì)本GTF，對(duì)于transcript元件，基因名字 (Gene symbol)在第18列。
sed -n '2p' GRCh38.gtf | sed 's/"/\t/g' | tr '\t' '\n' | sed = | sed 'N;s/\n/\t/'
1 chr20
2 havana
3 transcript
4 87250
5 97094
6 .
7 +
8 .
9 gene_id
10 ENSG00000178591
11 ; gene_version
12 6
13 ; transcript_id
14 ENST00000608838
15 ; transcript_version
16 1
17 ; gene_name
18 DEFB125
19 ; gene_source
20 ensembl_havana
21 ; gene_biotype
22 protein_coding
23 ; transcript_name
24 DEFB125-202
25 ; transcript_source
26 havana
27 ; transcript_biotype
28 processed_transcript
29 ; transcript_support_level
30 2
31 ;這個(gè)查看信息在哪一列是很常用的檢查文件結(jié)構(gòu)提取對(duì)應(yīng)信息的方式，簡(jiǎn)化為一個(gè)腳本checkCol.sh
檢查某個(gè)文件的指定行（默認(rèn)為第一行）
checkCol.sh -f GRCh38.gtf
1 chr20
2 ensembl_havana
3 gene
4 87250
5 97094
6 .
7 +
8 .
9 gene_id "ENSG00000178591"; gene_version "6"; gene_name "DEFB125"; gene_source "ensembl_havana"; gene_biotype "protein_coding";檢查標(biāo)準(zhǔn)輸入的第一行
sed 's/"/\t/g' GRCh38.gtf | checkCol.sh -f -
1 chr20
2 ensembl_havana
3 gene
4 87250
5 97094
6 .
7 +
8 .
9 gene_id
10 ENSG00000178591
11 ; gene_version
12 6
13 ; gene_name
14 DEFB125
15 ; gene_source
16 ensembl_havana
17 ; gene_biotype
18 protein_coding
19 ;提取基因啟動(dòng)子序列
首先確定啟動(dòng)子區(qū)域，這里定義轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1000 bp和下游500 bp為啟動(dòng)子區(qū)域。
sed 's/"/\t/g' GRCh38.gtf | awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}{if($3=="gene") {if($7=="+") {start=$4-1000; end=$4+500;} else {if($7=="-") start=$5-500; end=$5+1000; } if(start<0) start=0; print $1,start,end,$14,$10,$7;}}' >GRCh38.promoter.bed啟動(dòng)子區(qū)域如下 （這個(gè)bed文件也可以用于ChIP-seq類型的數(shù)據(jù)分析確定peak是否在啟動(dòng)子區(qū)域）
head GRCh38.promoter.bed
chr20 86250 87750 DEFB125 ENSG00000178591 +
chr20 141369 142869 DEFB126 ENSG00000125788 +
chr20 156470 157970 DEFB127 ENSG00000088782 +
chr20 189181 190681 DEFB128 ENSG00000185982 -
chr20 226258 227758 DEFB129 ENSG00000125903 +
chr20 256736 258236 DEFB132 ENSG00000186458 +
chr20 266186 267686 AL034548.1 ENSG00000272874 +
chr20 290278 291778 C20orf96 ENSG00000196476 -
chr20 295968 297468 ZCCHC3 ENSG00000247315 +
chr20 347724 349224 NRSN2-AS1 ENSG00000225377 -然后提取序列。這里用到了bedtools工具，官方有提供編譯好的二進(jìn)制文件，下載下來(lái)即可使用。
# -name: 輸出基因名字（bed文件的第四列）
# -s: 考慮到正反鏈（對(duì)于啟動(dòng)子區(qū)域，是否考慮鏈的信息關(guān)系不太大）
bedtools getfasta -name -s -fi GRCh38.fa -bed GRCh38.promoter.bed >GRCh38.promoter.fa序列信息如下：
head GRCh38.promoter.fa | cut -c 1-60
>DEFB125::chr20:86250-87750(+)
ATAATTTGAAGTGAGGTAATGTGATTCCTCTAGTTTTGTTCTTTTTGCTTAGGATGGCTT
>DEFB126::chr20:141369-142869(+)
AATATTCAAGAGAATGCCAAGAAAGCTACAAGAACAAATAGCAGGTCAGTCGTTGCCTGG
>DEFB127::chr20:156470-157970(+)
ATATCCGTCACCTCAAACATTTATCATTTGTATTGGGAACATTCAAAATCCTCTCTTCTA
>DEFB128::chr20:189181-190681(-)
AAAAAAGAAAAAGAACTCCAAGTCTAATAAGACCAGAGACCTGCCCTTTATGGGTCTGCA
>DEFB129::chr20:226258-227758(+)
GAGTGGAAGGTGGGAGGAGGGAGAGGATGAGGAAAAATAACTAATGGACACTAGGCTTAA如果不想要坐標(biāo)信息，可對(duì)序列名字做一下簡(jiǎn)化
cut -d ':' -f 1 GRCh38.promoter.fa >GRCh38.promoter.simplename.fa
head GRCh38.promoter.simplename.fa | cut -c 1-60
>DEFB125
ATAATTTGAAGTGAGGTAATGTGATTCCTCTAGTTTTGTTCTTTTTGCTTAGGATGGCTT
>DEFB126
AATATTCAAGAGAATGCCAAGAAAGCTACAAGAACAAATAGCAGGTCAGTCGTTGCCTGG
>DEFB127
ATATCCGTCACCTCAAACATTTATCATTTGTATTGGGAACATTCAAAATCCTCTCTTCTA
>DEFB128
AAAAAAGAAAAAGAACTCCAAGTCTAATAAGACCAGAGACCTGCCCTTTATGGGTCTGCA
>DEFB129
GAGTGGAAGGTGGGAGGAGGGAGAGGATGAGGAAAAATAACTAATGGACACTAGGCTTAA提取基因序列
提取基因序列的操作也類似于提取啟動(dòng)子序列。這里要注意GFF文件的序列位置是從1開(kāi)始，而bed文件的位置是從0開(kāi)始，前閉后開(kāi)，所以要對(duì)序列的起始位置進(jìn)行-1的操作。
type="gene"
sed 's/"/\t/g' GRCh38.gtf | awk -v type="${type}" 'BEGIN{OFS=FS="\t"}{if($3==type) {print $1,$4-1,$5,$14,".",$7}}' >GRCh38.gene.bed
head GRCh38.gene.bed
chr20 87249 97094 DEFB125 . +
chr20 142368 145751 DEFB126 . +
chr20 157469 159163 DEFB127 . +
chr20 187852 189681 DEFB128 . -
chr20 227257 229886 DEFB129 . +
chr20 257735 261096 DEFB132 . +提取基因序列
bedtools getfasta -name -s -fi GRCh38.fa -bed GRCh38.gene.bed >GRCh38.gene.fa
# 查看序列
head GRCh38.gene.fa | cut -c 1-60
>DEFB125::chr20:87249-97094(+)
ACAGGAATTCATATCGGGGTGATCACTCAGAAGAAAAGGTGAATACCGGATGTTGTAAGC
>DEFB126::chr20:142368-145751(+)
GCCATACACTTCAGCAGAGTTTGCAACTTCTCTTCTAAGTCTTTATCCTTCCCCCAAGGC
>DEFB127::chr20:157469-159163(+)
CTCTGAGGAAGGTAGCATAGTGTGCAGTTCACTGGACCAAAAGCTTTGGCTGCACCTCTT
>DEFB128::chr20:187852-189681(-)
GGCACACAGACCACTGGACAAAGTTCTGCTGCCTCTTTCTCTTGGGAAGTCTGTAAATAT提取非編碼RNA的序列
在GTF文件中有轉(zhuǎn)錄本類型的注釋，包含下面這些注釋類型
ntisense_RNA
lincRNA
miRNA
misc_RNA
processed_pseudogene
processed_transcript
protein_coding
rRNA
scaRNA
sense_intronic
sense_overlapping
snoRNA
snRNA
TEC
transcribed_processed_pseudogene
transcribed_unitary_pseudogene
transcribed_unprocessed_pseudogene
unitary_pseudogene
unprocessed_pseudogene我們只篩選lincRNA
grep 'transcript_biotype "lincRNA"' GRCh38.gtf >GRCh38.lincRNA.gtf
gffread GRCh38.lincRNA.gtf -g GRCh38.fa -w GRCh38.lincRNA.fa
head GRCh38.lincRNA.fa | cut -c 1-60
>ENST00000608495
GTCGCACGCGCTGGCCAAACGGGCGCACCAGACACTTTTCAGGGCCCTGCCAAAGACCTC
CTGGCGTCCCAGACACAAGAGATCCAGGCCAAGACTCACACTTCACAAGATACACAGACA
GGAACAGGAAATTCCATGAAACTTCCATTTACCCAATTAGCCGGACTCACTGAGCCCCAG
TCAACCAACTCCTACTAAAATTAAAAAGTAATGTGTGGTATAGATTGGAATAATAGACAT
AAACGATGGGAGGCGGAGAGGGGTGAGGGTTGAAAAATTACCTATTGGGTGCAACATTCA
AATGGGGCACTAGAAGCCCACTCCACCACTATGCAATATATGTATTTGTACCCCGTAAAT提取一個(gè)個(gè)外顯子序列
獲取外顯子的坐標(biāo)
type="exon"
sed 's/"/\t/g' GRCh38.gtf | awk -v type="${type}" 'BEGIN{OFS=FS="\t"}{if($3==type) {print $1,$4-1,$5,$14,$20,$7}}' >GRCh38.exon.bed
# 查看文件內(nèi)容
head GRCh38.exon.bed
chr20 87249 87359 ENST00000608838 DEFB125 +
chr20 96004 97094 ENST00000608838 DEFB125 +
chr20 87709 87767 ENST00000382410 DEFB125 +
chr20 96004 96533 ENST00000382410 DEFB125 +
chr20 142368 142686 ENST00000382398 DEFB126 +
chr20 145414 145751 ENST00000382398 DEFB126 +
chr20 142633 142686 ENST00000542572 DEFB126 +
chr20 145414 145488 ENST00000542572 DEFB126 +
chr20 145578 145749 ENST00000542572 DEFB126 +
chr20 157469 157593 ENST00000382388 DEFB127 +提取序列
# -name: 輸出基因名字（bed文件的第四列）
# -s: 考慮到正反鏈（對(duì)于啟動(dòng)子區(qū)域，是否考慮鏈的信息關(guān)系不太大）
bedtools getfasta -name -s -fi GRCh38.fa -bed GRCh38.exon.bed >GRCh38.exon.fa
# 查看序列信息
head GRCh38.exon.fa | cut -c 1-60
>ENST00000608838::chr20:87249-87359(+)
ACAGGAATTCATATCGGGGTGATCACTCAGAAGAAAAGGTGAATACCGGATGTTGTAAGC
>ENST00000608838::chr20:96004-97094(+)
GTAGCTTTGAACCCCAAAAATGTTGGAAGAATAATGTAGGACATTGCAGAAGACGATGTT
>ENST00000382410::chr20:87709-87767(+)
ATGAATATCCTGATGCTGACCTTCATTATCTGTGGGTTGCTAACTCGGGTGACCAAAG
>ENST00000382410::chr20:96004-96533(+)
GTAGCTTTGAACCCCAAAAATGTTGGAAGAATAATGTAGGACATTGCAGAAGACGATGTT提取一個(gè)個(gè)內(nèi)含子序列
確定內(nèi)含子區(qū)域
sed 's/"/\t/g' GRCh38.gtf | awk 'BEGIN{OFS=FS="\t";oldtr="";}{if($3=="exon") {tr=$14; if(oldtr!=tr) {start=$5; oldtr=tr;} else {print $1,start,$4-1,tr,$20,$7; start=$5;} } }' >GRCh38.intron.bed
# 查看文件內(nèi)容
head GRCh38.intron.bed
chr20 87359 96004 ENST00000608838 DEFB125 +
chr20 87767 96004 ENST00000382410 DEFB125 +
chr20 142686 145414 ENST00000382398 DEFB126 +
chr20 142686 145414 ENST00000542572 DEFB126 +
chr20 145488 145578 ENST00000542572 DEFB126 +
chr20 157593 158773 ENST00000382388 DEFB127 +
chr20 189681 187852 ENST00000334391 DEFB128 -
chr20 227346 229277 ENST00000246105 DEFB129 +提取序列同上。
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