顯微鏡分辨率與相機(jī)分辨率

簡介

熒光顯微鏡中的分辨率定義為樣品上兩點(diǎn)之間仍可區(qū)分的最短距離。這主要由兩個(gè)因素決定；顯微鏡分辨率，即顯微鏡可以分辨的最小物體，以及相機(jī)分辨率，即相機(jī)檢測(cè)顯微鏡可以分辨的物體的能力。

顯微鏡的最大分辨率是物鏡數(shù)值孔徑和樣品發(fā)射波長的函數(shù)，而相機(jī)分辨率完全由像素大小決定。

然而，熒光顯微鏡的分辨率最終受到光的衍射極限的限制，例如，當(dāng)使用綠光 (510 nm) 時(shí)，該極限約為 220 nm。這為可以解決的問題設(shè)定了下限。因此，標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡中的常見做法是使用能夠達(dá)到此下限的顯微鏡設(shè)置來檢測(cè)最小的可分辨物體。使用傳統(tǒng)顯微鏡無法嘗試比這更低的分辨率，只有使用超分辨率技術(shù)才能打破光的衍射極限。

顯微鏡分辨率

光以波的形式傳播，因此當(dāng)它用透鏡聚焦到一個(gè)小點(diǎn)時(shí)，無論物鏡有多好，焦點(diǎn)的尺寸都會(huì)比實(shí)際的熒光團(tuán)大。

圖 1：在物鏡孔徑邊緣發(fā)生衍射的熒光發(fā)射器的衍射圖案。最終的衍射極限點(diǎn)在 x 和 y 方向可能是 200-300 nm，在 z 方向可能是 500-800 nm。

這是因?yàn)闊晒獍l(fā)射的波前（wavefront）在物鏡孔徑的邊緣發(fā)生衍射。這有效地將波前傳播出去，將熒光發(fā)射加寬為中心點(diǎn)大于原始熒光團(tuán)的衍射圖案（圖 1）。

衍射極限光斑的大小大約是發(fā)射光波長大小的一半，但由 Ernst Abbe 在 1873 年確定的完整方程為：

?? = ?? / 2NA

其中 d 是衍射極限光斑的大小，λ 是所用光的波長，2NA 是物鏡數(shù)值孔徑的 2 倍。

對(duì)于 GFP 發(fā)射波長為 ~510 nm 和高數(shù)值孔徑(NA 1.4)物鏡的情況，顯微鏡解析的熒光團(tuán)的大小為 182 nm。這比實(shí)際的熒光團(tuán)大得多，實(shí)際熒光團(tuán)可能只有 2 nm。

艾里斑

衍射極限光斑呈艾里斑的形狀（圖 2），以 George Biddell Airy 的名字命名。它由一個(gè)明亮的中心點(diǎn)和一系列圍繞它的衍射環(huán)組成。中心光斑的大小由發(fā)射光的波長和物鏡的數(shù)值孔徑?jīng)Q定。

圖 2 突出顯示了增加物鏡的數(shù)值孔徑如何減小艾里斑的尺寸，從而增加可分辨細(xì)節(jié)的數(shù)量。

圖 2：由低、高和高數(shù)值孔徑物鏡產(chǎn)生的艾里斑。

瑞利判斷

解析相鄰熒光團(tuán)的問題在于，隨著艾里斑靠得更近，它們彼此融合并變得無法解析（圖 3）。因此，在 1896 年，瑞利勛爵改進(jìn)了阿貝方程，以考慮到兩個(gè)熒光團(tuán)需要相距多遠(yuǎn)才能區(qū)分它們：

?? = 1.22?? / 2NA

通過這種改進(jìn)，使用高數(shù)值孔徑 (NA 1.4) 物鏡區(qū)分兩個(gè) GFP 熒光團(tuán)所需的距離將為 222 nm。

圖 3：兩個(gè)艾里斑合并，直到兩個(gè)中心點(diǎn)無法再區(qū)分

物鏡分辨率限制

表 1 中的信息突出顯示了使用 GFP (510 nm) 發(fā)射的各種不同放大倍數(shù)物鏡和數(shù)值孔徑可能存在的分辨率限制。

需要注意的是，物鏡放大倍數(shù)對(duì)分辨率沒有影響，數(shù)值孔徑是唯一重要的值。100x、1.40 NA 物鏡與 60x、1.40 NA 物鏡具有相同的分辨能力。同樣，100x、1.30 NA 物鏡與 40x、1.30 NA 物鏡具有相同的分辨能力。

這就引出了一個(gè)明顯的問題，如果 40 倍放大率達(dá)到相同的分辨率，為什么要使用 100 倍或 60 倍放大率？當(dāng)使用更高放大倍率的物鏡時(shí)，視野會(huì)無緣無故地受到限制。

通過使用較低放大倍率的物鏡，從 100x、1.30 NA 物鏡變?yōu)?40x、1.30 NA 物鏡，視野增加了 450%。這表示樣品面積增加了 450%，而分辨率沒有損失。

同樣，通過將 60x、1.30 NA 物鏡更改為 40x、1.30 NA 物鏡，樣品面積增加了 200%。

那么為什么要使用更高放大倍率的物鏡呢？這就是相機(jī)分辨率的用武之地。放大倍數(shù)在科學(xué)相機(jī)的分辨率中起著重要作用。

表 1：使用具有 GFP (510 nm) 發(fā)射的不同物鏡的顯微鏡分辨率。所有數(shù)字都假設(shè)在一個(gè)完美對(duì)中和優(yōu)化的光學(xué)系統(tǒng)下。

相機(jī)分辨率

相機(jī)分辨率定義為相機(jī)傳感器對(duì)圖像進(jìn)行采樣的能力，科學(xué)相機(jī)的分辨率完全取決于像素的大小和放大的程度。圖 4 突出顯示了科學(xué)相機(jī)像素大小是如何通過物鏡放大倍率改變的。

圖 4：科學(xué)相機(jī)的分辨率取決于像素大小。6.5 μm 像素尺寸縮小 10 倍物鏡導(dǎo)致有效像素尺寸為 0.65 μm，40x 物鏡導(dǎo)致有效像素尺寸為 0.1625 μm，60x 物鏡導(dǎo)致有效像素尺寸為 0.108 μm

將相機(jī)分辨率與顯微鏡分辨率相匹配的最明顯方法似乎是將表 1 中給出的衍射極限分辨率與單個(gè)像素的大小相匹配。然而，這種情況并非如此。目標(biāo)不僅僅是匹配顯微鏡分辨率，而是區(qū)分相鄰物體。

奈奎斯特采樣

如圖 5 所示，如果顯微鏡分辨率與單個(gè)像素的大小相匹配，則兩個(gè)相鄰的物體可能會(huì)成像到相鄰的像素上。在這種情況下，將無法在結(jié)果圖像中將它們識(shí)別為兩個(gè)獨(dú)立的對(duì)象。

分離相鄰特征需要存在至少一個(gè)具有不同強(qiáng)度值的中間像素。因此，可以實(shí)現(xiàn)的最佳空間分辨率需要將顯微鏡的衍射極限分辨率與傳感器上的兩個(gè)像素相匹配。這稱為奈奎斯特采樣，可以使用以下公式計(jì)算：

相機(jī)分辨率 =（像素大小/物鏡倍率）x 2.3

Camera Resolution = (Pixel Size / Objective Power) x 2.3

圖 5：奈奎斯特采樣。在第一個(gè)示例中，相機(jī)傳感器像素小于對(duì)象但無法完全解析細(xì)節(jié)，導(dǎo)致圖像為假。使用 Nyquist 采樣，傳感器像素大小減半，因此可以以兩倍的速率進(jìn)行采樣，并解析樣本中的細(xì)節(jié)。

將相機(jī)分辨率與顯微鏡分辨率相匹配

表 2 和表 3 說明了在不同放大倍率下實(shí)現(xiàn)奈奎斯特采樣所需的像素大小。這些表格提供了之前提出的問題的答案：如果 40 倍放大倍數(shù)達(dá)到相同分辨率，為什么要使用 100 倍或 60 倍放大倍數(shù)？

如前所述，要使用 GFP (510 nm) 實(shí)現(xiàn) Nyquist 采樣并匹配顯微鏡分辨率，相機(jī)分辨率應(yīng)達(dá)到 0.22 μm。表 2 顯示，對(duì)于 40x 物鏡，6.5 μm 像素太大，因?yàn)橛纱水a(chǎn)生的相機(jī)分辨率為 0.37 μm。6.5 μm 像素被認(rèn)為足以進(jìn)行 60 倍的放大，但是，因?yàn)橛纱水a(chǎn)生的相機(jī)分辨率達(dá)到 0.25 μm。

因此需要較小的像素來實(shí)現(xiàn) 40 倍的奈奎斯特采樣。表 3 顯示 4.25 μm 的較小像素尺寸達(dá)到 0.24 μm 的相機(jī)分辨率，放大倍數(shù)為 40 倍，滿足 Nyquist 要求。

表 2：物鏡放大率對(duì) 6.5 μm 像素可能的相機(jī)分辨率的影響以及是否匹配 Nyquist 采樣

表 3：物鏡放大率對(duì) 4.25 μm 像素可能的相機(jī)分辨率的影響以及是否實(shí)現(xiàn)奈奎斯特采樣

本節(jié)中提供的數(shù)據(jù)表明，可以使用的最低放大倍數(shù)受相機(jī)像素大小的限制，需要足夠小以匹配顯微鏡分辨率。

較小像素的相機(jī)允許使用較低的放大倍數(shù)，這具有在視場(chǎng)中看到更多樣本的優(yōu)勢(shì)。

總結(jié)

有兩種類型的分辨率；顯微鏡分辨率和相機(jī)分辨率。顯微鏡分辨率由物鏡的數(shù)值孔徑和發(fā)射波長決定，而相機(jī)分辨率由像素大小決定。

使用較低 (40x) 放大倍率的物鏡可以達(dá)到衍射極限分辨率，但像素大小會(huì)受到限制。為了解決這個(gè)問題，已經(jīng)開發(fā)出具有較小像素的相機(jī)，以允許研究人員轉(zhuǎn)向較低放大倍率的物鏡。這具有在不犧牲分辨率的情況下增加視野的優(yōu)點(diǎn)。只需從 60 倍切換到 40 倍，研究人員就有望將通量提高 200%。

來源南京衡橋儀器有限公司，

?翻譯轉(zhuǎn)載自?Teledyne Photometrics

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