三維超分辨顯微成像技術(shù)的研究進(jìn)展

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1.  引言

傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像技術(shù)能夠清晰分辨出三維亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這對(duì)細(xì)胞生物學(xué)研究來說是必不可少的。然而由于阿貝衍射極限的存在，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率受到了限制。

在可見光波段，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率僅為200～300nm，軸向分辨率為橫向分辨率的1/3～1/2，只能達(dá)到500～800nm。顯然，這兩個(gè)尺寸都遠(yuǎn)大于許多亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

于是，科學(xué)家們基于物理和化學(xué)方法提出了許多突破光學(xué)衍射極限的顯微成像技術(shù)。在眾多技術(shù)中，基于熒光標(biāo)記的超分辨顯微成像技術(shù)將橫向分辨率和軸向分辨率分別提高了至少10倍和6倍，一躍成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。

熒光顯微成像技術(shù)都是通過熒光團(tuán)的亮態(tài)(on state)和暗態(tài)(off state)，按時(shí)間順序記錄其亞衍射極限特性，并且熒光分子處于亮態(tài)或暗態(tài)的概率與激發(fā)光強(qiáng)呈非線性相關(guān)。通過對(duì)熒光團(tuán)進(jìn)行坐標(biāo)定向或者隨機(jī)時(shí)間開關(guān)處理，熒光顯微鏡就能夠在亞衍射極限范圍內(nèi)清晰地分辨出熒光標(biāo)記的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了從傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡到超分辨光學(xué)顯微鏡的轉(zhuǎn)變。通過此原理，科學(xué)家們也首次通過熒光顯微鏡進(jìn)行了許多基本的生物學(xué)研究。

目前，超分辨顯微成像主要分為三種技術(shù)：第一種技術(shù)以受激輻射損耗 (STED)顯微術(shù)為代表。STED采用兩束激光，一束用于激發(fā)熒光分子產(chǎn)生熒光，另一束中心光強(qiáng)為零的環(huán)形損耗光用于損耗熒光并將發(fā)光區(qū)域限制在衍射極限以下，于是通過點(diǎn)掃描的方式即可實(shí)現(xiàn)超分辨成像。第二種技術(shù)以單分子定位顯微術(shù)(SMLM)為主，其代表性技術(shù)有光激活定位顯微鏡(PALM)和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(STORM)。SMLM 通過使用激活光和激發(fā)光控制成像區(qū)域中每次成像時(shí)僅有少量、隨機(jī)、離散的熒光分子發(fā)光，再通過高斯擬合得到每個(gè)熒光分子高精度的空間定位，最后將所有圖片進(jìn)行疊加，形成一幅超分辨圖像。第三種技術(shù)是結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)(SIM)。SIM 通過使用具有空間結(jié)構(gòu)的光束將空間高頻成分編碼到熒光圖像，再通過圖像算法解碼重構(gòu)出超分辨圖像。

理論上，SIM 的分辨率極限為傳統(tǒng)光學(xué)顯微術(shù)的兩倍，而 STED 技術(shù)和 SMLM 的分辨率沒有限制。

 

2. 受激輻射損耗顯微鏡的三維成像技術(shù)研究進(jìn)展

在受激輻射損耗顯微成像中，中心光強(qiáng)為零的環(huán)形暗斑可以用來提高橫向分辨率，但由于軸向上并不能損耗熒光，軸向分辨率并未得到提升。此外，由于像差的存在，成像的深度也受限。因此，在三維成像中，提高軸向分辨率、增大成像深度、實(shí)現(xiàn)具有各向同性三維分辨率的深度成像至關(guān)重要。

2.1三維分辨率

根據(jù)STED的成像原理，要想提升顯微成像系統(tǒng)的三維空間分辨率，實(shí)現(xiàn)樣品的三維超分辨成像，關(guān)鍵是要讓損耗光在樣品焦平面處聚焦成一個(gè)三維中空暗斑，只有暗斑中心所在位置可以發(fā)出熒光，其他位置的熒光都被損耗了。要想實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，目前的技術(shù)主要有基于單物鏡架構(gòu)的3D-STED 和基于雙物鏡架構(gòu)的isoSTED。

基于單物鏡架構(gòu)的3D-STED 的技術(shù)關(guān)鍵是對(duì)損耗光加載0/π環(huán)形相位(也叫作“Top-hat”相位)，這種相位分布可以讓損耗光經(jīng)過物鏡聚焦成具有焦面中心強(qiáng)度最小、焦面上下強(qiáng)度最大分布的三維暗斑。在這種架構(gòu)(z-STED)下，基于單物鏡架構(gòu)的3D-STED 技術(shù)相比于共聚焦顯微成像技術(shù)，可以獲得軸向6倍和橫向2倍的分辨率提升，即獲得90～110nm的近乎各向同性的三維分辨率。為了進(jìn)一步增大橫向的損耗、提升橫向分辨率，可以通過再引入一路損耗光加載傳統(tǒng)的0～2π渦旋相位，產(chǎn)生一個(gè)橫向分布的“甜甜圈”形狀的環(huán)形暗斑，最終將兩個(gè)暗斑在焦面進(jìn)行非相干強(qiáng)度疊加，得到橫向43nm和軸向125nm的分辨率。

                           

圖1：基于單物鏡架構(gòu)的3D-STED納米顯微技術(shù)原理圖

 

如圖1所示，損耗光經(jīng)過偏振分束器后分為水平偏振光STEDxy和垂直偏振光 STEDz，分別加載0～2π渦旋相位板和0/π環(huán)形相位板，二者隨后經(jīng)過偏振分束器合束，接著與激發(fā)光通過二色鏡合束，最終經(jīng)過光束掃描組件和1/4波片一起進(jìn)入物鏡。

值得注意的是，為了保證兩束損耗光的非相干性并形成高質(zhì)量的三維暗斑，兩束損耗光脈沖在時(shí)間上有一定的延遲。

除了可以使用相位板對(duì)損耗光進(jìn)行波前調(diào)制，也可以利用空間光調(diào)制器(SLM)對(duì)其進(jìn)行波前調(diào)制。相位型的液晶空間光調(diào)制器往往只能對(duì)一種偏振光進(jìn)行調(diào)制，這種偏振光的偏振方向與液晶取向一致。圖1展示了這樣的一種架構(gòu)：空間光調(diào)制器只對(duì)水平偏振光進(jìn)行調(diào)制，其加載的第一個(gè)全息圖是0～2π渦旋相位，相位的第二個(gè)全息圖是0/π環(huán)形相位；水平偏振光STEDxy和垂直偏振光 STEDz，經(jīng)SLM第一個(gè)全息圖的調(diào)制后，只有損耗光STEDxy受到調(diào)制；兩束損耗光隨后依次經(jīng)過1/4波片、透鏡，再經(jīng)反射鏡原路返回經(jīng)過透鏡、1/4波片，此時(shí)原來的垂直偏振光STEDz已經(jīng)變成水平偏振光，受到SLM 第二個(gè)全息圖的調(diào)制，而原來的水平偏振光STEDxy已經(jīng)變成垂直偏振光，不再被SLM 調(diào)制。通過調(diào)節(jié)兩束損耗光的光強(qiáng)比，可以分別調(diào)節(jié)橫向和縱向的損耗能力，最終可以得到不同形狀的熒光點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)(PSF)。

 

圖2：3D-STED 技術(shù)中的PSF結(jié)果

 

圖2展示了3D-STED 技術(shù)中激發(fā)光、損耗光和熒光 PSF在xy 和xz平面的強(qiáng)度分布。

值得注意的是，SLM的表面要和物鏡后焦面光學(xué)共軛。

此外，利用SLM 還可以很方便地對(duì)暗斑的形狀及位置進(jìn)行控制，例如：可以通過澤尼克系數(shù)對(duì)損耗光波前進(jìn)行補(bǔ)償，達(dá)到像差校正的目的；可以隨時(shí)切換到二維 STED模式 (兩個(gè)全息圖都加載0～2π 渦旋相位)；可以調(diào)節(jié)全息圖的大小以及環(huán)形相位的直徑以匹配不同的物鏡；可以通過加載光柵相位實(shí)現(xiàn)和激發(fā)光的自動(dòng)對(duì)準(zhǔn)。

基于雙物鏡架構(gòu)的isoSTED 的技術(shù)關(guān)鍵是損耗光通過兩個(gè)對(duì)置物鏡在樣品面發(fā)生干涉而形成暗斑。采用兩個(gè)對(duì)置物鏡的4Pi顯微鏡，對(duì)熒光樣品進(jìn)行雙向激發(fā)和雙向探測(cè)，等效于在軸向上增大了物鏡的孔徑（得到近乎4π的空間立體角）,這樣可以減小PSF 的軸向大小，極大地提升軸向分辨率。

2002年，研究人員首次將 STED 與 4Pi技術(shù)相結(jié)合，獲得了33nm 的軸向分辨率。在這種被稱為“STED-4Pi”的顯微鏡中，通過對(duì)STED 光引入像差來消除聚焦暗斑除中心以外的其他極小值，從而消除熒光PSF沿軸向分布的旁瓣。進(jìn)一步地，2008年研究人員提出的isoSTED 技術(shù)可以在此架構(gòu)下提升橫向分辨率，得到 40～45nm 的各向同性分辨率。

圖3：isoSTED的光學(xué)裝置

 

isoSTED 的光學(xué)裝置簡(jiǎn)化示意圖如圖3所示，一束損耗光STEDxy通過0～2π渦旋相位板后經(jīng)偏振分束器分為兩路，二者分別進(jìn)入兩個(gè)對(duì)置物鏡，在樣品面發(fā)生相長(zhǎng)干涉，形成一個(gè)橫向分布的暗斑，產(chǎn)生橫向上的熒光損耗。另一束損耗光STEDz經(jīng)偏振分束器后分為兩路，二者分別進(jìn)入兩個(gè)對(duì)置物鏡，在樣品面發(fā)生相消干涉，形成一個(gè)縱向分布的暗斑，產(chǎn)生縱向上的熒光損耗。最終，這兩個(gè)暗斑在樣品面進(jìn)行非相干強(qiáng)度疊加，生成一個(gè)三維中空暗斑，如圖4所示。

 

圖4：isoSTED技術(shù)中的PSF結(jié)果

 

通過調(diào)節(jié)STEDxy和STEDz的光強(qiáng)比，最終可以得到一個(gè)近乎球形的熒光PSF。值得注意的是，為了避免這兩個(gè)暗斑在樣品面相互干涉、影響三維中空暗斑質(zhì)量，STEDxy和STEDz這兩束損耗光通常由兩臺(tái)激光器分別產(chǎn)生；此外，最終生成的三維中空暗斑在焦面上下有零值暗斑，使得此處的熒光不會(huì)被損耗掉，最終熒光PSF 在焦面上下會(huì)有兩個(gè)旁瓣，形成偽像，這個(gè)旁瓣可以在后期通過線性或非線性反卷積算法消除；另外，由于像差隨著深度的增加而增大，該技術(shù)只能成像深度在1μm 以內(nèi)的樣品。

2020 年，研究人員將自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)用于isoSTED系統(tǒng)（AO isoSTED），以三維亞50nm 的分辨率對(duì)全細(xì)胞和組織樣品進(jìn)行成像。AO isoSTED 技術(shù)和2008 年研究人員提出的isoSTED技術(shù)相比，有如下三方面的改進(jìn)：1) STEDxy和STEDz來自同一激光器的不同偏振成分，并采用邁克耳孫干涉儀裝置對(duì)兩束光進(jìn)行脈沖延遲以破壞其相干性，同時(shí)利用一個(gè)SLM對(duì)兩束光分別進(jìn)行相位調(diào)制，對(duì)STEDz加載離焦相位，以有效地消除熒光PSF在焦面上下的旁瓣；2)在原來的兩條干涉臂各放入一片1/4波片，使得激光在進(jìn)入物鏡前由原來的線偏光轉(zhuǎn)為圓偏光，這樣可以降低激光對(duì)熒光分子選擇性激發(fā)與損耗的概率，同時(shí)減小圖像中激光導(dǎo)致的背景；3)在原來的兩條干涉臂各放入一個(gè)變形鏡，采用無傳感自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)對(duì)像差進(jìn)行校正。

值得注意的是，盡管isoSTED技術(shù)實(shí)現(xiàn)了厚樣品成像，其三維分辨率也高于3D-STED技術(shù)，但是由于雙物鏡的對(duì)準(zhǔn)要求極為嚴(yán)苛，其仍面臨系統(tǒng)復(fù)雜、搭建調(diào)試難度大的問題。

2016年，考慮到4Pi系統(tǒng)的高度軸向?qū)ΨQ性，北京大學(xué)Yang等提出鏡面增強(qiáng)超分辨顯微技術(shù)( MEANS)，用一面反射鏡取代樣品后面的載玻片，使得入射光和反射光在鏡面發(fā)生干涉，得到軸向110nm的分辨率，其與二維STED技術(shù)相結(jié)合( MEANS- STED)，可以在STED的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將橫向分辨率提升2倍，獲得19nm的橫向分辨率，但是其成像深度僅在離鏡面200nm范圍內(nèi)。

總的來說，使用單物鏡的鏡面增強(qiáng)超分辨顯微技術(shù)降低了iSoSTED技術(shù)的系統(tǒng)復(fù)雜度。

上述技術(shù)旨在通過縮小熒光發(fā)光區(qū)域即減小熒光PSF體積來提升成像時(shí)的三維分辨率。而膨脹顯微技術(shù)(ExSTED)首先通過化學(xué)手段對(duì)樣品進(jìn)行各向同性的物理膨脹，然后進(jìn)行成像，這樣三維分辨率得到提升，且提升的倍數(shù)與膨脹的倍數(shù)相當(dāng)。進(jìn)一步地, ExSTED技術(shù)結(jié)合了樣品膨脹顯微技術(shù)和STED超分辨顯微技術(shù)，可以得到亞10nm的二維分辨率和亞50nm的三維分辨率。值得注意的是，亞50nm的三維分辨率是采用水鏡得到的，這樣做是為了得到更大的成像深度，但如果采用油鏡的話，可以進(jìn)一步提升三維分辨率，但折射率不匹配引起的球差會(huì)使得成像深度受限。

 

2.2三維成像深度

在三維成像應(yīng)用中，保持在不同深度處有較高的三維分辨率是很有必要的。成像深度往往受限于成像過程中的光散射和像差。此外，光散射和像差也會(huì)影響STED成像中激發(fā)光和損耗光的對(duì)準(zhǔn)以及三維暗斑的質(zhì)量。為了減小成像過程中的光散射和像差，增大三維成像深度，主要從選擇合適物鏡、采用樣品清潔技術(shù)和使用自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)這三個(gè)方面進(jìn)行考慮。

 

在進(jìn)行厚樣品的深度成像時(shí)，物鏡浸沒液和組織樣品的折射率不匹配會(huì)導(dǎo)致球差的產(chǎn)生，且球差隨著成像深度的增加而增加。雖然高折射率的浸沒液會(huì)讓物鏡擁有更大的數(shù)值孔徑，集光能力更強(qiáng)，理論上會(huì)帶來更高的成像分辨率，但是其和樣品折射率不匹配而導(dǎo)致的球差會(huì)降低成像質(zhì)量。因此，針對(duì)不同的組織樣品，選擇合適的物鏡浸沒液至關(guān)重要。在對(duì)富含脂質(zhì)的腦組織切片進(jìn)行成像時(shí)，由于其折射率更接近甘油(折射率1.45)而不是水(折射率1.33)，因此選擇甘油物鏡更合適。此外，額外的校正環(huán)可以進(jìn)一步補(bǔ)償折射率不匹配問題。2011年，研究人員使用帶校正環(huán)的甘油物鏡，對(duì)活腦切片進(jìn)行成像，以二維60～80nm的分辨率揭示了突觸內(nèi)的肌動(dòng)蛋白分布，成像深度可達(dá)120μm。在對(duì)活細(xì)胞成像時(shí)，由于其折射率更接近水(折射率1.33)而不是油(折射率1.518)，因此，選擇水鏡更為合適。此外，額外的自適應(yīng)光學(xué)元件，如空間光調(diào)制器，可以對(duì)損耗光的暗斑進(jìn)行球差校正。2018年,研究人員利用水鏡，結(jié)合空間光調(diào)制器，在z-STED架構(gòu)下實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞樣品的成像，軸向成像深度可達(dá)37μm，軸向分辨率可達(dá)150nm，對(duì)充滿水的熒光珠成像時(shí)穿透深度可達(dá)180μm。在對(duì)膨脹樣品進(jìn)行成像時(shí)，由于樣品存在于吸水膨脹后的凝膠之中，凝膠由水構(gòu)成，其折射率為1.33，因此選擇水鏡更為合適。2018年研究人員等在ExSTED中，選用NA為1.2的水鏡后成像深度由使用油鏡時(shí)的不到5μm增大到50μm，并獲得70nm的三維分辨率。

使用自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)可以進(jìn)一步校正由樣品折射率變化導(dǎo)致的像差。自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)通過動(dòng)態(tài)校正元件（如空間光調(diào)制器和變形鏡），采用特定的像差測(cè)量技術(shù)和控制方法（如直接波前測(cè)量和間接像差優(yōu)化）來補(bǔ)償畸變的波前，提高成像質(zhì)量。將自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)用于STED 顯微術(shù)時(shí)，空間光調(diào)制相比于變形鏡對(duì)光的偏振和波長(zhǎng)敏感，因此常將其放置于損耗路，用來調(diào)制損耗光，而變形鏡常被放置于激發(fā)光、損耗光和熒光共同所在的光路，用來調(diào)制所有光束。

值得注意的是，為了保證調(diào)制效果，空間光調(diào)制器和變形鏡需要和物鏡后焦面呈光學(xué)共軛。

一種測(cè)量像差的方法是通過波前傳感器（如 Shack-Hartmann波前傳感器）來直接進(jìn)行測(cè)量，但這種方法往往需要一個(gè)點(diǎn)狀的熒光目標(biāo)作為“導(dǎo)星”；另一種測(cè)量像差的方法是通過間接進(jìn)行像差優(yōu)化，按照一定的控制模式（如澤尼克系數(shù)）不斷改變動(dòng)態(tài)校正元件的相位分布，獲取一系列圖像，并對(duì)每一幅圖像進(jìn)行像質(zhì)評(píng)價(jià)（如圖像總強(qiáng)度或銳度），從而確定最佳的相位分布；此外，還可以通過測(cè)量不同深度的焦斑圖像，利用相位恢復(fù)算法，得到畸變的波前分布。

此外，將中空貝塞爾光束作為損耗光、高斯光束作為激發(fā)光的GB-STED 技術(shù)，充分利用中空貝塞爾光束的非衍射和自重構(gòu)特性，可以在類似腦組織灰質(zhì)的樣品約100μm 深度處成像，橫向分辨率約為100nm。

3. 單分子定位顯微鏡的三維成像技術(shù)研究進(jìn)展

在單分子定位顯微成像中，熒光分子的橫向位置可以根據(jù)其圖像中類高斯分布的質(zhì)心確定。可是對(duì)于軸向定位，雖然可以通過離焦的光斑大小進(jìn)行軸向定位，但是無像差的 PSF 關(guān)于焦平面對(duì)稱，這使得 PSF 在焦平面兩側(cè)距離相同的位置處是相同的，無法確定離焦方向。除此之外，PSF的軸向位置變化靈敏度較低、離焦信號(hào)信噪比較低、定位深度依賴于系統(tǒng)景深等問題也亟須解決。

圖5：無像差的 PSF 在不同軸向位置的圖像

 

圖5為無像差的PSF 在不同軸向位置的圖像。于是，人們提出了多種三維成像技術(shù)來提高SMLM 的軸向分辨能力、增大成像深度，例如 PSF工程、多位置觀測(cè)、超臨界角熒光和4Pi顯微鏡等其他方法。

3.1PSF工程

由于無像差的PSF在焦平面兩側(cè)是具有對(duì)稱性的，那么可以人為改變PSF的空間分布，將PSF的軸向位置信息編碼到PSF的橫向形狀上，并通過橫向形狀進(jìn)行軸向定位。這類方法被統(tǒng)稱為PSF工程。

3.1.1  像差

由于無像差的PSF在焦平面兩側(cè)具有對(duì)稱性，那么在PSF中引入不具有對(duì)稱性的像差就可以打破這種局面，實(shí)現(xiàn)軸向定位。早在1994年，研究人員通過在PSF中引入像散，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)熒光顆粒的三維示蹤(SPT)，軸向分辨率可達(dá)12nm。

圖6：3D STORM示意圖

 

基于此技術(shù)，2008年研究人員實(shí)現(xiàn)了3D-STORM。如圖6所示,在傳統(tǒng)的熒光成像光路中，他們?cè)谖镧R( objective)和筒鏡( imaging lens)之間加入了一個(gè)焦距為1m的柱透鏡( cylindrical lens)使得圖像在x和y方向受到不同程度的調(diào)制。于是，熒光分子的PSF橢圓度和方向隨著軸向位置的變化而變化。當(dāng)熒光分子恰好在平均焦平面時(shí)，PSF在x和y方向上具有相等的寬度，圖像呈圓形；當(dāng)熒光分子在其他位置時(shí)，PSF在x和y方向上聚焦程度不同，圖像呈橢圓形。因此，如果標(biāo)定好PSF在x和y方向上寬度關(guān)于z的變化曲線(校正曲線)，那么只需要測(cè)量PSF在這兩個(gè)方向上的寬度就可以確定熒光分子的軸向位置。

在繪制校正曲線時(shí)，首先使量子點(diǎn)或熒光分子稀疏地附著在蓋玻片表面，保持樣品臺(tái)不動(dòng)，在z方向移動(dòng)物鏡以恒定速率進(jìn)行掃描，得到不同軸向位置的PSF。然后使用二維橢圓高斯函數(shù)進(jìn)行擬合，得到PSF中心坐標(biāo)以及x和y方向的寬度。使用離焦函數(shù)進(jìn)行擬合，并對(duì)折射率不匹配進(jìn)行修正，最終可以得到校正曲線。

由于柱透镋改變了PSF的形狀，橫向擬合誤差增大,x和y方向的分辨率大致為20～30nm，略低于傳統(tǒng)2DSTORM。x方向的分辨率大致為50～70nm，約為x和y方向的2～3倍。

此方法光路較為簡(jiǎn)單，成本低，是目前最受歡迎的方法。當(dāng)然，引入像散的缺點(diǎn)也很明顯。單次成像的定位深度較淺，通常限制在距離平均焦平面±350nm的范圍，要對(duì)厚生物樣品進(jìn)行成像依賴于軸向掃描，因?yàn)榫嚯x基準(zhǔn)面越遠(yuǎn)，PSF逐漸展寬，信噪比會(huì)變低。并且，樣品和物鏡之間折射率的不匹配會(huì)產(chǎn)生球差，這使得在距離基準(zhǔn)面越遠(yuǎn)位置的球差影響越大。但是值得注意的是，在基準(zhǔn)面以下，球差影響較小。另外，選擇柱透鏡的焦距時(shí)，需要在像散強(qiáng)度和信噪比之間進(jìn)行權(quán)衡，像散越強(qiáng)，橫向PSF對(duì)于軸向位置變化的分辨率就會(huì)越高，具有深度信息的橫向PSF對(duì)軸向位置變化的靈敏度就會(huì)越高，但是信噪比也會(huì)越低。若想同時(shí)

保證信噪比和軸向成像深度，可以使用雙物鏡,2012年研究人員在此系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，將單物鏡改為雙物鏡，光子利用效率提升了兩倍，單分子定位精度在橫向和軸向分別為4nm和8nm。在對(duì)肌動(dòng)蛋白絲進(jìn)

3.1.2  自干涉

2018年研究人員提出了自干涉三維超分辨顯微鏡(SELFI)。SELFI的原理如下：對(duì)于焦點(diǎn)平面附近的熒光分子，所收集的熒光的波前曲率很大程度上取決于分子的軸向位置，并且在焦點(diǎn)處表現(xiàn)出曲率符號(hào)反轉(zhuǎn)。因此，在成像平面中，通過干涉測(cè)量對(duì)熒光波前進(jìn)行分析，可以得到熒光分子的軸向位置。他們通過在距離像面幾微米的位置處加入一個(gè)相位衍射光柵對(duì)PSF 進(jìn)行改進(jìn)，產(chǎn)生了一種空間重疊度大于90%的自相干PSF，它的干涉圖案隨著熒光分子的軸向位置的變化而改變，并且干涉圖案的包絡(luò)線對(duì)應(yīng)著原始PSF的橫向分布。因此，根據(jù)干涉圖案就可以進(jìn)行三維定位。而且，SELFI對(duì)像差不敏感，可以讓3D MLM 深入完整組織內(nèi)部進(jìn)行三維成像。于是，他們把SELFI與像散技術(shù)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明在成像深度大于10μm 時(shí)，像散技術(shù)的軸向定位精度明顯下降，但是SELFI依舊保持著各向同性的定位精度。隨后，他們使用SELFI對(duì)厚樣品中肌動(dòng)蛋白和 OCT4 進(jìn)行三維成像，其中在對(duì) OCT4進(jìn)行成像時(shí)，SELFI揭示了OCT4在未清除的組織球體內(nèi)部深達(dá)50μm 的空間分布，這也證明了SELFI具有對(duì)厚樣品進(jìn)行三維成像的能力。2019年他們實(shí)現(xiàn)了 SELFI的活細(xì)胞三維成像。當(dāng)然，SELFI的軸向定位深度相比于像散技術(shù)并沒有很大提升，可以實(shí)現(xiàn)700nm(±350nm)深度下的軸向定位。

3.1.3  傅里葉面調(diào)制

為了解決成像深度較淺的問題，2009 年 研究人員報(bào)道了一種使用雙螺旋PSF(DH-PSF)進(jìn)行三維成像的技術(shù)。如圖7所示，在4f 系統(tǒng)中，他們使用SLM 在傅里葉面對(duì) PSF 進(jìn)行調(diào)制，通過在模態(tài)平面疊加特定的高斯-拉蓋爾模式，使PSF 擁有類似于DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)。在距離焦平面不同深度的位置上，DH-PSF 兩個(gè)主瓣之間連線與水平方向夾角的不同，反映了熒光分子軸向位置的變化。與像散的方法一樣，在繪制校正曲線后，就可以確定熒光分子的軸向位置。

對(duì)于單顆粒成像，這種方法的成像深度可以達(dá)到2μm，三個(gè)方向的分辨率都可以達(dá)到10～20nm，并且使用最大似然估計(jì)法時(shí)，分辨率還可以繼續(xù)提高。但是 DH-PSF 旁瓣(side lobes)的能量占用和SLM 的能量損失，導(dǎo)致光子利用效率較低，需要較長(zhǎng)的曝光時(shí)間才能提高定位精度，因此這種方法只適用于高亮度的熒光染料和熒光蛋白。若想要減少SLM 的能量損失并對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像，則可以使用專門定制的相位板（phase mask）代替 SLM，DH-PSF 被廣泛地用于生物樣品(如微管)的成像，其橫向和軸向分辨率分別能達(dá)到20nm和30nm，成像深度最大可以達(dá)到2.5μm。

后來，人們基于理論或者實(shí)驗(yàn)調(diào)制出了多種PSF，用于增大成像深度、提高定位精度，例如：phase ramp PSF、corkscrew PSF、self-bending PSF、saddle-point PSF、tetrapod PSFs、 bisected PSF、Airy-beam PSF和 twin-Airy PSF等。

3.2多位置觀測(cè)

PSF 的橫向尺寸在焦平面附近變化緩慢，僅憑單獨(dú)的2D PSF 擬合很難確定其軸向位置。因此，除了采用 PSF 工程修改 PSF 形狀，也可以通過在物方或者像方的不同位置進(jìn)行同時(shí)成像，從中提取物體的軸向位置。

3.2.1  雙平面

圖7：dMUM 和 MUM 系統(tǒng)示意圖

 

如圖7所示的多焦面顯微鏡(MUM)和雙物鏡多焦面顯微鏡(dMUM)，用于提升三維成像的軸向分辨能力。對(duì)于 MUM，當(dāng)兩個(gè)探測(cè)器分別位于焦平面(0nm)和遠(yuǎn)離焦平面(500nm)的位置時(shí)，對(duì)于同一個(gè)分子發(fā)出的熒光信號(hào)，探測(cè)器接收到的信號(hào)強(qiáng)度是不同的，換而言之就是橫向PSF 的形狀不同。因此，可以通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得深度和PSF 形狀(信號(hào)強(qiáng)度分布)之間的關(guān)系，確定熒光分子的軸向位置，或者可以通過 PSF 模型的理論計(jì)算進(jìn)行定位。相對(duì)于傳統(tǒng)顯微鏡，MUM 提升了焦平面附近的定位精度，為增大定位深度，可以繼續(xù)增加平面?zhèn)€數(shù)、增大間距，但是每個(gè)探測(cè)器分配到的光子數(shù)也會(huì)減少，導(dǎo)致定位精度下降，因此通常將 MUM 和其他方法相結(jié)合以彌補(bǔ)不足，例如艾里光束 PSF。dMUM 使用了類似于 4Pi 和I5M的雙物鏡結(jié)構(gòu)，提高了光子利用效率，定位精度得到進(jìn)一步提升，在SPT 中的軸向定位精度最高可以達(dá)到10nm 左右，定位深度可達(dá)1～2μm。但是相比于 MUM，dMUM 的系統(tǒng)復(fù)雜度較高。

另外需要注意的是,MUM 和 dMUM 都存在著一個(gè)問題，對(duì)于NA較大的物鏡，對(duì)偏離物鏡和管鏡預(yù)設(shè)的焦平面進(jìn)行成像會(huì)引入球差和其他高級(jí)像差，影響定位精度，并且在偏移較大的情況下像差的影響會(huì)加重。

3.2.2  多平面

為減小多平面觀測(cè)中像差的影響，可以使用定制的衍射光學(xué)器件將物體發(fā)出的光衍射為多個(gè)級(jí)次,并同時(shí)無像差地成像在同一平面的不同位置上，不同級(jí)次衍射光的相位不同，對(duì)應(yīng)著不同位置的平面，如圖8所示。

圖8：使用畸變衍射光柵和透鏡進(jìn)行成像

 

一種像差校正的多焦點(diǎn)顯微鏡(MFM)，設(shè)計(jì)了一種多焦點(diǎn)衍射光柵，將熒光衍射為9個(gè)級(jí)次，即得到了9 個(gè)間距相同的平面。使用 MFM 對(duì) RNA聚合酶II的異質(zhì)核遷移進(jìn)行三維示蹤，單次成像深度可以達(dá)到 4μm。相比于dMUM使用雙物鏡和MUM使用多個(gè)分束鏡產(chǎn)生多個(gè)平面的方法，MFM的系統(tǒng)較為簡(jiǎn)單，只需在4f系統(tǒng)的傅里葉面加入多焦點(diǎn)衍射光柵即可。

圖9：MFM系統(tǒng)示意圖

 

2014年研究人員將MFM(圖9)應(yīng)用于 STORM/PALM中，實(shí)現(xiàn)了多色3 D SMLM全細(xì)胞成像。他們對(duì)哺乳動(dòng)物線粒體網(wǎng)絡(luò)和酵母微管進(jìn)行了成像，單次成像的定位深度可達(dá)4μm，橫向和軸向分辨率分別為20nm和50nm。但是，多焦點(diǎn)衍射光柵的衍射效率較低，9個(gè)級(jí)次的理論極限僅為67%左右，想要提高光子利用效率，可以增加衍射級(jí)次或者使用多重相位光柵代替原本的二元光柵，從而可將9個(gè)級(jí)次的光子利用效率提升至74%，甚至更高。由上可知，想要增大單次成像的定位深度，最直接的辦法就是增加平面?zhèn)€數(shù)。但是，這也需要在定位精度和平面?zhèn)€數(shù)之間權(quán)衡，平面?zhèn)€數(shù)的增多會(huì)讓每個(gè)平面分配到的光子數(shù)減少，導(dǎo)致每個(gè)平面的定位精度降低。換而言之，位于特定平面上的熒光分子是這些圖像中某個(gè)子集的焦點(diǎn)，同時(shí)在其他熒光分子進(jìn)行定位時(shí)熒光分子又是背景噪聲，用于提升定位精度的光子個(gè)數(shù)僅占探測(cè)到總光子數(shù)的小部分。因此，雙/多平面技術(shù)直接應(yīng)用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的3 D SMLM成像具有一定難度，因此多平面技術(shù)也通常和其他技術(shù)(如像散)進(jìn)行結(jié)合并且也在3D SPT成像中應(yīng)用廣泛。

 

3.2.3  多角度

另一種實(shí)現(xiàn)在不同位置同時(shí)觀測(cè)的方法就是多角度觀測(cè)，此方法通常表現(xiàn)為在樣品基底加入微反射鏡、增加視場(chǎng)角或成像光路引入視差。

（1）  增加視場(chǎng)角

2009年，研究人員次使用錐形微反射鏡孔基底對(duì)直徑為190nm 的聚苯乙烯顆粒進(jìn)行高速3D SPT 成像，三維定位精度達(dá)到了20nm。如圖10所示，當(dāng)顆粒發(fā)生軸向移動(dòng)時(shí)，雖然其不影響對(duì)顆粒的直接成像，但是熒光在微型反射鏡的入射點(diǎn)是上下移動(dòng)的，使得顆粒的反射成像在橫向上移動(dòng)，即微型反射鏡將軸向位移轉(zhuǎn)化為橫向位移，并且結(jié)合其他位置的反射成像實(shí)現(xiàn)軸向定位。

圖10：錐形微反射鏡孔三維成像原理圖

 

基于此技術(shù)，2010年研究人員提出了一種虛體積超分辨成像顯微鏡(VVSRM)，并將其應(yīng)用于PALM/FPALM 和PAINT。如圖11所示，他們制作了一種反射鏡基底，傾斜的反射鏡可以對(duì)熒光分子側(cè)面進(jìn)行反射成像，通過分束鏡和輔助透鏡可將實(shí)像和離焦的反射像同時(shí)成像在同一個(gè)平面上，再對(duì)橫向定位的結(jié)果進(jìn)行坐標(biāo)變換，即可實(shí)現(xiàn)軸向定位。當(dāng)反射鏡傾斜角度為45°時(shí)，理論上可以實(shí)現(xiàn)空間上各向同性的分辨率，各向同性也使得其體積測(cè)量的準(zhǔn)確度高于共聚焦顯微鏡。若光子數(shù)超過5000，則定位精度能達(dá)到亞20nm。

 

圖11：VVSRM系統(tǒng)示意圖

 

不難看出在VVSRM 中加入反射鏡基底，不但補(bǔ)償了分束鏡帶來的能量損失，而且減小了軸向漂移和像差的影響。然而，反射鏡基底也帶來了不利的因素，例如樣品制備的難度增大。

（2）  引入視差

最早引入視差的方法通常是在物鏡后焦面或者后焦面的共軛面加入楔形棱鏡或者反射鏡以將成像光路按角度分成兩個(gè)通道,使得物體的軸向位移表現(xiàn)為兩個(gè)橫向圖像之間相對(duì)位置的改變，在 3D SPT中都可以達(dá)到納米級(jí)的精度。圖12 為反射鏡三維成像示意圖。

圖12：反射鏡三維成像示意圖

 

2019年，研究人員首次提出傅里葉光場(chǎng)顯微鏡(FLFM)。他們通過將微透鏡陣列放在成像光路的傅里葉面上的方法引入視差，實(shí)現(xiàn)了小鼠腎臟切片的傳統(tǒng)三維顯微成像3～5μm 的分辨率。2020年研究人員將此技術(shù)引入 SMLM 中，并將其命名為單分子光場(chǎng)顯微鏡(SMLFM),分辨率得到了顯著提升。如圖 13 所示，在探測(cè)器的接收面上，MLA 將成像光路在橫向上劃分為二維陣列，陣列的每個(gè)區(qū)域都可以測(cè)量光場(chǎng)的四維信息以及二維空間和角度信息。每個(gè)微透鏡都會(huì)對(duì)物體的一部分波前進(jìn)行成像，若物體發(fā)生軸向位移，則在陣列的不同區(qū)域，其圖像的橫向位置會(huì)朝著孔徑波前平均梯度的方向移動(dòng)，并且位移長(zhǎng)度與平均梯度成比例關(guān)系。例如，當(dāng)物體靠近物鏡，圖像向陣列中心外側(cè)移動(dòng)；反之，圖像向中心內(nèi)側(cè)移動(dòng)。通過理論模型進(jìn)行計(jì)算即可獲取軸向位置信息，因此微透鏡陣列可以測(cè)量光場(chǎng)的五維信息。

圖13：SMLFM系統(tǒng)示意圖

 

3.3超臨界角熒光

樣品和玻璃界面之間存在折射率不匹配的情況，這對(duì)在分界面附近的熒光分子輻射角度分布有很大影響。在距離分界面的一定范圍內(nèi)，熒光分子輻射的一部分熒光會(huì)以低于臨界角的范圍射入玻璃，稱為低臨界角熒光(UAF)；另一部分熒光則會(huì)以超過臨界角的范圍入射，稱為超臨界角熒光(SAF)。根據(jù)折射定律，在幾何光學(xué)中SAF 是不可能存在的，SAF 也因此被稱為“禁止的光線”。但是，從物理光學(xué)的角度分析，熒光分子所輻射的倏逝分量會(huì)在分界面另一側(cè)的介質(zhì)(如玻璃)中傳播，并且會(huì)隨著熒光分子和分界面的距離的增加而急劇下降。因此，SAF 的能量貢獻(xiàn)會(huì)隨著此距離的增加而急劇下降，而在此范圍內(nèi) UAF 的能量貢獻(xiàn)幾乎不變。

 

圖14：SAF原理圖

 

如圖14 所示，當(dāng)熒光分子與分界面(z=0nm)接觸時(shí)，SAF光子數(shù)大致等于總光子數(shù)的一半；當(dāng)熒光分子與分界面距離大于等于λ(z≥λ)時(shí)，SAF光子數(shù)幾乎為0，并且光子數(shù)隨著其與分界面距離的增加呈指數(shù)形式下降。

 

3.3.1  SAFM

基于此原理，2004年研究人員首次提出超臨界角熒光顯微鏡(SAFM)，用于在共聚焦顯微鏡中同時(shí)分析熒光分析物表面結(jié)合和未結(jié)合部分的相關(guān)信息。2010年他們提出3D-SAFM技術(shù)，并將其應(yīng)用在三維顯微成像中。如圖15所示，在3D-SAFM中，SAF和UAF分別由拋物面型聚光器和物鏡收集，,角度范圍分別為60°～75°(最小角度可通過光闌調(diào)節(jié))和0°～24°。在一定范圍內(nèi)，UAF的能量分布與激光相同，相比于SAF幾乎沒有改變，因此可以使用SAF和UAF的比值和軸向位置的關(guān)系進(jìn)行定位，而且SAF還避免了外界因素對(duì)成像釆集過程中漂移的影響。

圖15：3D SAFM原理圖

 

3.3.2  DONALD

2015 年研究人員將dSTORM 與SAFM結(jié)合，提出一種可直接進(jìn)行軸向定位探測(cè)的光學(xué)納米顯微系統(tǒng)(DONALD)。在 DONALD 中，他們使用高數(shù)值孔徑(0.49NA )的物鏡來收集包含 SAF在內(nèi)的落射熒光，在成像光路的 DONALD 模塊中，落射熒光被分束鏡分為兩部分，一部分為 SAF 和UAF，另一部分為UAF(SAF 被光闌阻擋)。因?yàn)樵诟?NA 物鏡的后焦面(共軛面)上，SAF 和遠(yuǎn)場(chǎng)UAF 在徑向上是分開的，所以可以將 UAF 和SAF 分開。這樣在 EMCCD 平面上，可以通過將落射熒光與 UAF 相減得到 SAF，再計(jì)算SAF 與 UAF 的比值，實(shí)現(xiàn)軸向定位。理論上，DONALD可以實(shí)現(xiàn)5～10nm 的軸向定位精度。但是，在實(shí)際成像時(shí)，DONALD 的軸向定位精度可以達(dá)到約15nm；在對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞纖維型肌動(dòng)蛋白和微管)成像時(shí)，軸向分辨率為40～80nm，且隨著深度的增大，分辨率逐漸降低。這是因?yàn)榉质鲗?dǎo)致 UAF 和 SAF 的能量都被舍棄了50%，用于軸向定位的光子數(shù)減少，信噪比降低，外加像差的影響，DONALD 的定位精度和理論值有所差距。

 

3.3.3  dSLAM

圖16：dSALM系統(tǒng)示意圖

 

如圖 16 所示，在 dSALM 的系統(tǒng)中，研究人員使用一種定制的橢圓形反射鏡在后焦面上將SAF 從落射熒光中直接分離出來。在 UAF 所在光路中，他們通過加入柱透鏡引入較弱的像散，用于橫向定位和精度較低的軸向定位。在定位算法方面，dSALM 的直接分離法讓其定位精度得到 4 倍的提高、有效景深得到4倍的增大。在對(duì)熒光珠的3D成像和DNA 折紙四面體的3D DNA-PAINT成像中，各個(gè)方向上的定位精度均為4～5nm，分辨率可以達(dá)到30nm；在對(duì)細(xì)胞網(wǎng)格蛋白小窩和微管的3D DNA-PAINT 成像中，分辨率可以達(dá)到50nm。此方法雖然提升了定位精度，但是dSALM 引入了弱像散，導(dǎo)致成像深度較大時(shí)定位精度無法得到保證，因此其單次成像定位的深度較小，實(shí)驗(yàn)中最大成像深度為600nm。

此外，dSALM 使用高數(shù)值孔徑(1.7NA)物鏡所需的高折射率油鏡，導(dǎo)致其無法使用光激活熒光染料；較大的視場(chǎng)像差將視場(chǎng)限制在20μm。

當(dāng)然，除了使用分離 UAF 和 SAF 的方法進(jìn)行三維成像，還可以使用其他系統(tǒng)結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的方法，例如離焦。但是，離焦產(chǎn)生的像差會(huì)影響定位精度和校正曲線的繪制。

 

3.4 4Pi顯微鏡

由于單個(gè)物鏡最多只能收集一半球形波前，在不犧牲橫向分辨率的情況下，很難實(shí)現(xiàn)軸向分辨率的提升。但是，如果可以在成像系統(tǒng)的焦平面的另一側(cè)上也放置一個(gè)物鏡(共焦面物鏡)收集波前的另一半，這樣可以得到近乎完整的球形波前，由于恢復(fù)了對(duì)稱性，PSF 的軸向延展也會(huì)大大減小，各向同性分辨率也因此實(shí)現(xiàn)，并且收集的光子數(shù)也提升了1倍。

圖17：4Pi-SMLM 系統(tǒng)示意圖

 

基于此理念,在20 世紀(jì)90 年代 研究人員提出了4Pi顯微鏡(4Pi microscopy)。如圖17所示，因?yàn)橐粋€(gè)物鏡在理論上最多可以覆蓋空間立體角的一半(2π)，所以兩個(gè)相對(duì)的物鏡可以實(shí)現(xiàn)全空間立體角(4π)，故將其命名為4Pi顯微鏡。實(shí)際上，空間立體角通常可以實(shí)現(xiàn) 2.5π~3π。在SMLM中使用4Pi可將干涉條紋中的相位信息轉(zhuǎn)化為軸向位置信息，進(jìn)而提高軸向分辨率，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了4通道同時(shí)記錄相位信息的成像系統(tǒng)。

 

3.4.1  iPALM

圖18：iPALM系統(tǒng)示意圖

 

2009 年研究人員首次將 PALM 與 4Pi結(jié)合，并將其命名為干涉測(cè)量型 PALM(iPALM)。如圖18所示，iPALM使用3通道分束器將熒光分成3個(gè)光束并產(chǎn)生自干涉，且每個(gè)通道之間的相位差為π/3，找到每幀圖像中熒光分子的中心即可實(shí)現(xiàn)橫向定位；對(duì)于軸向定位，同時(shí)獲取3個(gè)通道中同一熒光分子的強(qiáng)度并通過強(qiáng)度與軸向位置的關(guān)系曲線，即可得到該分子的相對(duì)軸向位置，最終實(shí)現(xiàn)三維定位。iPALM 的 橫向和軸向定位精度分別為20nm 和10nm，對(duì)生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維成像時(shí)可以達(dá)到20nm 以下的三維分辨率，因此iPALM可以清晰分辨出細(xì)胞微管、質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在這其中軸向分辨率最高可以達(dá)到10nm左右。當(dāng)然，iPALM 也有局限性，由于他們把熒光波前當(dāng)作平面波來分析，iPALM 的成像定位深度較小，僅為225nm。若想擴(kuò)大軸向定位范圍，則可以將iPALM 與其他技術(shù)相結(jié)合，不過其他技術(shù)的缺陷也可能會(huì)被引入其中。

 

3.4.2  4Pi-SES

2008年研究人員首次提出了將4Pi應(yīng)用于SMLM 的方案，并且提出了4通道分束器的概念。對(duì)于單個(gè)分子定位，此方案理論上可以實(shí)現(xiàn)5～10nm 的三維分辨率。2011年，他們報(bào)道了4Pi單分子開關(guān)顯微鏡，并成功實(shí)現(xiàn)了雙色三維成像。4Pi-SMS采用了一種三角形4Pi腔，4Pi干涉腔的每個(gè)臂上都加入了一個(gè)1/4 波片(光軸與安裝面呈45°)和巴比涅-索雷補(bǔ)償器,使得p偏振光相對(duì)于s偏振光分別產(chǎn)生 Δ?a 和 Δ?b 的相位延遲，并且保證 Δ?a-Δ?b=π/2。最終，通過傾斜反射鏡在空間上將熒光根據(jù)偏振態(tài)和傳播方向分成4個(gè)通道并同時(shí)成像在同一相機(jī)上。對(duì)于軸向定位范圍超過λ/2的熒光分子，分子的軸向位置之差為λ/2 的整數(shù)倍時(shí)，會(huì)導(dǎo)致干涉圖案相同，使得軸向定位不準(zhǔn)確，進(jìn)而導(dǎo)致圖像中包含軸向偏移的偽像。為此，他們不僅計(jì)算了相機(jī)上熒光分子高斯加權(quán)強(qiáng)度的全局相位，還計(jì)算了其高斯加權(quán)第三中心矩陣的全局相位。因此，在成像深度為1.5λ(～650nm)時(shí)，4Pi-SMS的軸向分辨率至少為5.4～6.6nm，橫向分辨率為8.3～22.3nm。于是,4Pi-SMS被應(yīng)用于人體血小板和哺乳動(dòng)物微管的三維成像中，成像深度為700～1000nm。此外，相比于iPALM，4Pi-SMS 的多色成像也較容易實(shí)現(xiàn)，只需在原本的光路中加入一個(gè)二向色鏡，通過透過率和不同偏振態(tài)之間的關(guān)系以及兩種偏振態(tài)的能量比率判斷染料種類，實(shí)現(xiàn)多色成像。

 

3.4.3  W-4PiSESN

為了進(jìn)一步增大成像深度， 2016年研究人員提出了一種全細(xì)胞4Pi單分子開關(guān)納米顯微鏡 (W-4PiSMSN)。雖然前人解決了厚度大于250nm的樣本存在偽像的問題，但是若想實(shí)現(xiàn)對(duì)厚度為5～10μm 的哺乳動(dòng)物的全細(xì)胞成像，4Pi-SMS依然會(huì)受到定位密度和像差的影響。

圖19：W-4PiSMSN系統(tǒng)示意圖

 

如圖19所示，為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的全厚度上實(shí)現(xiàn)10～20nm 的三維分辨率，他們改進(jìn)了4Pi-SMS的系統(tǒng)設(shè)計(jì)，在4Pi干涉腔的每個(gè)臂中都加入了可變形鏡，用于校正系統(tǒng)的各種像差和優(yōu)化 PSF；其次，他們根據(jù)Brown等提出的4Pi-PSF 偏心距分析算法進(jìn)行改進(jìn)，將4Pi-PSF 的干涉相位(可以進(jìn)行精確的軸向定位,不能區(qū)分干涉峰)及其包含像散的偏心距(可以將軸向定位范圍縮小到每個(gè)干涉峰,不能提供干涉精度)所提供的信息共同用于軸向定位。因此，使用 W-4PiSMSN 對(duì)噬菌體、核孔和纖毛等細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行大體積三維成像，其三維分辨率均可達(dá)到10～20nm,并且成像深度可達(dá)10μm左右。

綜上所述，4Pi-SMS的確可以實(shí)現(xiàn)很高的分辨率，相比于其他技術(shù)有很大的優(yōu)勢(shì)。但是，4Pi-SMS的系統(tǒng)復(fù)雜程度較高，成本較高，搭建周期長(zhǎng)(通常為1年)，存在較多的不穩(wěn)定性，因此全世界僅有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室擁有4Pi-SMS，這也限制了4Pi-SMS在世界各地生物實(shí)驗(yàn)室中的廣泛應(yīng)用。

參考資料：

王瀟，涂世杰等， 三維超分辨顯微成像技術(shù)的研究進(jìn)展，激光與光電子學(xué)進(jìn)展

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