收藏|北大生信平臺"單細胞分析、染色質(zhì)分析"視頻和PPT分享

北京大學(xué)生物信息平臺在2018年的暑假和秋季組織了兩期關(guān)于單細胞分析、染色質(zhì)分析的研討班，報告人來自于鄧興旺老師組、李程老師組、湯富酬老師組、謝曉亮老師組、張學(xué)工老師組、張澤民老師組。內(nèi)容涉及單細胞分析的基本生物學(xué)問題、聚類、可視化、細胞圖譜、發(fā)育圖譜和多組學(xué)分析，染色質(zhì)可及性、三維結(jié)構(gòu)等。授權(quán)生信寶典發(fā)表出來，讓更多朋友可以參與。

視頻和PPT在https://space.bilibili.com/16813275/#/和http://202.205.131.32/forum/upload/forum.php?mod=viewthread&tid=324&extra=page%3D1，后臺回復(fù) 北京大學(xué)生物信息平臺獲取可點擊的鏈接。

秋季討論班內(nèi)容

描述為本人根據(jù)PPT和自己的理解所注，有不當(dāng)處為本人而非演講人責(zé)任，具體可聽視頻學(xué)習(xí)。

I. 單細胞分析模塊

1. 單細胞分析的生物學(xué)問題：The biology of single-cell genomics，9月17日，主講人：王龍騰（李程組）https://share.weiyun.com/5LgmWyO，（沒有回放視頻）

   龍騰一定是《工作細胞》的忠實粉絲，從這個萌化了的日本動漫入手引出人體大約有37兆2千億細胞。之前流傳一個說法，人體內(nèi)的細菌比人的細胞多，在2006年的cell文章對此作了詳細闡述，人體內(nèi)細菌數(shù)目與人的細胞數(shù)目在同一數(shù)量級，但質(zhì)量小的太多。一個70 kg的成年人，細胞重量在46 kg，細菌重量只有0.2 kg。

   有點發(fā)散了，后面展開講受精卵卵裂形成ICM、胚胎干細胞、多能性干細胞、各個譜系進一步分化，以此作為鋪墊, 既包含細胞之間的共性(可被常規(guī)bulk測序捕獲)，又展示細胞類型的豐富和異質(zhì)性，這就引出了單細胞測序的優(yōu)勢。可以進行細胞分型、發(fā)育譜系構(gòu)建、移植前遺傳篩選等基礎(chǔ)和臨床的應(yīng)用。單細胞多組學(xué)可以從染色質(zhì)構(gòu)想、結(jié)構(gòu)層面解析調(diào)控的異質(zhì)性。展望一下，超高分辨率成像也許可以所見既所得的解決這個“被高中生物騙了這么多年，原來人體內(nèi)細胞的DNA是有不同的？”的問題。

   另外一個沒提到的問題，單細胞測序細胞量大，尤其是來源于不同的個體或取樣跨度時間長時，一定注意批次效應(yīng)的影響，李程老師的ComBat是GEO數(shù)據(jù)分析批次校正的常用工具。DESeq2差異基因分析和批次效應(yīng)移除中也有介紹。

2. scRNA-seq data visualization and clustering，10月8日，主講人：陳文昌 鄒子恒（清華大學(xué)張學(xué)工組）鏈接：https://share.weiyun.com/5TgOgDM，（視頻地址：https://www.bilibili.com/video/av33441560）

   文昌兄主要講述了單細胞分析常用的降維算法tSNE的原理和應(yīng)用。PCA的線性降維我們比較熟悉了，把線性相關(guān)的變量轉(zhuǎn)換為線性無關(guān)的向量。其操作方式是對原始矩陣的協(xié)方差矩陣進行對角化處理獲得協(xié)方差矩陣為對角陣的一組新變量，即實現(xiàn)了線性降維。線性降維算法的一個主要問題是它們集中將不相似的數(shù)據(jù)點放置在較低維度區(qū)域時，數(shù)據(jù)點相距甚遠。

   但是為了在低維、非線性流型上表示高維數(shù)據(jù)，我們也需要把相似的數(shù)據(jù)點靠近在一起展示，這并不是線性降維算法所能做的。tSNE把點的高維空間的距離轉(zhuǎn)換成點的相似度的概率，維持高維空間和低維空間中一對點之間的條件概率差值總和最小。同時使用t-分布的長尾性解決高維數(shù)據(jù)映射到低維時的重疊問題。t-SNE算法定義了數(shù)據(jù)的局部和全局結(jié)構(gòu)之間的軟邊界，既可以使點在局部分散，又在全局聚集，同時照顧近距離和遠距離的點。其性能優(yōu)于任何非線性降維算法。具體實現(xiàn)見還在用PCA降維？快學(xué)學(xué)大牛最愛的t-SNE算法吧,  附Python/R代碼。

   聚類算法有K-means (相似的SOM自組織特征圖聚類)、SC3 (一致聚類),  Seurat (圖聚類)、迭代聚類如層級聚類等。聚類的難點還在于其穩(wěn)定性和聚類數(shù)目的確定，silhouette index是一個度量指標(biāo)。

   

3. 單細胞分析與細胞圖譜繪制，10月15日，主講人：石強（李程組）, 鏈接：https://share.weiyun.com/5kljVnj

   以骨關(guān)節(jié)炎文章為例，展示了單細胞轉(zhuǎn)錄組的分析過程。從PCA結(jié)果看，細胞整體分型不明顯，而且兩個主成分的貢獻率之和不足14%。但細胞在PC2維度與骨關(guān)節(jié)炎的各個階段有些吻合，隨后選擇與PC2正貢獻和負貢獻的基因進行可視化展示 (一維的可視化效果優(yōu)于二維展示)。

   隨后是tSNE分型和Pseudospace發(fā)育軌跡分析、Marker鑒定等?？梢暬饕?a data-linktype="2">熱圖、散點圖、箱線圖為主。功能分析主要是GSEA基因集富集分析。具體畫圖還是見高顏值免費在線繪圖。

   

4. 單細胞分析與發(fā)育，10月29日，主講人：李莉（湯富酬組），鏈接：鏈接：https://share.weiyun.com/5p7I1Nd

   Cell Stem Cell文章 Single-Cell RNA-Seq Analysis Maps Development of Human Germline Cells and Gonadal Niche Interactions的一作講壇。單細胞的分析都是套路分析，關(guān)鍵在于樣品獲取、實驗的穩(wěn)定性和結(jié)果的生物意義解讀(喬院士和湯老師強強聯(lián)合)。本文主要圍繞胚胎生殖細胞發(fā)育過程講述單細胞轉(zhuǎn)錄組、甲基化組和染色質(zhì)可及性的分子調(diào)控。落腳點是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號通路。生信老司機以中心法則為主線講解組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用和生信分析心得 可以給生信的學(xué)習(xí)之路帶來一些新的想法。

5. 單細胞多組學(xué)，11月5日，主講人：張倩（李程組），鏈接：https://share.weiyun.com/5p7I1Nd

   同一個細胞，不同的調(diào)控。單細胞多組學(xué)有sci-CAR同時檢測基因表達和染色質(zhì)可及性，scNMT-seq同時檢測染色質(zhì)可及性、DNA甲基化和基因表達，connect-seq譜系追蹤和轉(zhuǎn)錄組，在神經(jīng)研究中應(yīng)用較多。近來看到一篇追蹤iPS重編程的工作，很有意思，回頭解讀下。這個視頻重點在單細胞ATAC-seq技術(shù)的原理、應(yīng)用和分析，有一部分Cicero的R代碼實戰(zhàn)。

   10X官網(wǎng)有不少視頻，是了解單細胞技術(shù)的好的素材。基因組瀏覽器是展示多組學(xué)信號的合適工具。

   

II. 染色質(zhì)分析模塊

1. 3D genome and its disorganization in diseases，11月19日，主講人：李瑞風(fēng)（李程組）鏈接：https://share.weiyun.com/5p7I1Nd

   通常人類細胞核大小為6 um，內(nèi)有抻開后長度為3.0 m的46條染色體(3億堿基對，每個堿基對高度是0.34 nm)。想象一下你如何能把3米的繩子放在6 um的小球中，更別說DNA上還有組蛋白的結(jié)合。

   染色體在細胞核內(nèi)高度壓縮纏繞，各自占有自己的一部分空間稱為chromosome territories。早期通過FISH技術(shù)鑒定，現(xiàn)在有Hi-C、ChIA-PET、OCEAN-C (李程老師組2018年發(fā)表，可同時檢測TAD，compartment和開放染色質(zhì)區(qū)域)等。3D基因組的3個層面：Compartment (Compartment A: 開放的活性區(qū)域，Compartment B: 致密的沉默區(qū)域， 10 Mb尺度)，TAD (拓撲結(jié)構(gòu)域，1 Mb尺度，不同物種和細胞系之間相對保守，與常見組蛋白修飾、CTCF結(jié)合關(guān)聯(lián)較好)，Loops (300 kb尺度，介導(dǎo)enhancer-promoter互作等, 細胞系之間變化較大)。

   后面是一作講壇，結(jié)合李程老師組Nature communication發(fā)表的關(guān)于多發(fā)性骨肉瘤的3D結(jié)構(gòu)失調(diào)展示TAD與CNV的關(guān)系。3D基因組應(yīng)用的一個例子還是趾的發(fā)育，這是增強子功能的經(jīng)典案例，也是Cell和媒體的常客。

   

2. ATAC-seq，分析流程與案例，11月26日，主講人：孫林華（鄧興旺 錢偉強組）鏈接：https://share.weiyun.com/5p7I1Nd

   ATAC-seq全稱Assay for Transposase-Accessible chromatin用于檢測開放的染色質(zhì)區(qū)域，其基本操作是用Transposase Tn5切割DNA并在切點處連上接頭序列，供下游分離擴增測序。實驗難度低于ChIP系列的富集測序，結(jié)果具有廣譜性，既可以展示核小體定位 (測序片段中間部分)，也可以研究開放染色質(zhì)區(qū)域(測序片段兩端部分)。配合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合Motif分析可在一定程度起到替代ChIP-seq的作用，尤其是抗體缺失的情況下。

   這個報告講述了ATAC-seq的原理、可用的生信分析工具、在動植物分子調(diào)控研究中的應(yīng)用。ATAC-seq基本分析與ChIP類似，只是根據(jù)關(guān)注的重點確定參數(shù)的選擇。

   

3. Introduction to Hi-C experiment and data analysis，12月3日，主講人：李夢帆（李程組）鏈接：https://share.weiyun.com/5p7I1Nd

   Hi-C實驗和分析的系統(tǒng)介紹，比較詳細，可以作為學(xué)習(xí)的起點。測序成本的下降，給Hi-C提供了很好的契機，測序一次浪費一半以上的reads，背后都是錢啊。不過基于Hi-C的拓展應(yīng)用如染色體組裝、單體型鑒定都提供了好的應(yīng)用場景。

   

4. 基于成像的染色質(zhì)分析，12月10日，主講人：侯英萍（李程組）鏈接：https://share.weiyun.com/5p7I1Nd

   基于FISH (Fluoresence in situ hybridization)的原位DNA結(jié)構(gòu)鑒定和RNA表達的原位細胞類型鑒定。配合超高分辨率顯微鏡加精巧的實驗設(shè)計，也可以一定程度的實現(xiàn)高通量的所見即所得。MERFISH是著名華人學(xué)者莊小威教授2015年開發(fā)的大規(guī)模RNA成像技術(shù)，根據(jù)不同細胞類型表達基因的不同在原位器官鑒定細胞類型的空間分布。

   

5. 染色質(zhì)分析與多組學(xué)整合，12月17日，主講人：劉玉婷（李程組） 鏈接：https://share.weiyun.com/5p7I1Nd      

   多組學(xué)整合分析本質(zhì)是把不同組學(xué)鑒定出來的元件根據(jù)特征細分、分類后做圖譜、做交集 (Nature綜述|整合組學(xué)分析護航健康，推動精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代的到來！)。其研究要么起始于文獻，要么起始于對數(shù)據(jù)的觀察，這里面還是基因組瀏覽器的作用不可忽視。觀察到基本模式后，就是去寫程序檢測基本模式是否具有普遍性和顯著性，這部分沒有成熟的工具，工具組合可以提供一些幫助，最主要的是自己學(xué)些編程了。(回復(fù)生信寶典福利第一波獲取我們自寫的Python、Linux、R學(xué)習(xí)教程)

6. 染色質(zhì)分析中的新概念、新方法和新工具，12月24日，主講人：賈璐萌（李程組）鏈接：https://share.weiyun.com/5p7I1Nd

   一作解讀，OCCAN-C, 李程老師組2018年發(fā)表，可同時檢測TAD，compartment和開放染色質(zhì)區(qū)域。

III. 網(wǎng)上資源：

• 單細胞分析課程：http://hemberg-lab.github.io/scRNA.seq.course/index.html (你也可以用bookdown整理出這樣漂亮的教程)

• 單細胞分析軟件集成：https://github.com/seandavi/awesome-single-cell

• 染色質(zhì)與三維基因組分析課程：https://github.com/hms-dbmi/3d-genome-processing-tutorial, https://github.com/hms-dbmi/hic-data-analysis-bootcamp

• 染色質(zhì)分析相關(guān)軟件：https://github.com/dekkerlab，https://github.com/theaidenlab/juicer，https://github.com/nservant/HiC-Pro，https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/HiTC.html

暑期討論班內(nèi)容

單細胞實驗與分析（2018.6-8月，這部分沒有配套視頻）

1. An introduction to bulk and single-cell RNA-seq：2018年6月25日，主講人:徐子晗（李程組) 鏈接：https://share.weiyun.com/5dLF79v

2. The advances in scRNA-seq techniques: 2018年7月2日，主講人：李莉（湯富酬組） 鏈接：https://share.weiyun.com/59ryjRX

3. Pre-processing and variation of scRNA-seq data：2018年7月9日，主講人：石強（李程組) 鏈接：https://share.weiyun.com/5bGebsN 介紹了基本單細胞分析流程和常用工具，主要講述了噪音的來源和校正方法。單細胞前期的分析跟bulk測序還是一致的，工具也有通用性，39個轉(zhuǎn)錄組分析工具，120種組合評估(轉(zhuǎn)錄組分析工具哪家強-導(dǎo)讀版)適合作為選擇依據(jù)。

4. scRNA-seq data analysis: Imputation,  Cluster,  and differential expression: 2018年7月16日，主講人：李子逸（張澤民組）鏈接：https://share.weiyun.com/5dN7wuZ 單細胞分析流程概述，cellranger的使用。即使在Windows下分析，也不要用Excel，以免Excel改變了你的基因名，30% 相關(guān)Nature文章受影響，NCBI也受波及。

5. scRNA-seq data analysis: single cell trajectory：2018年7月23日，主講人：張倩（李程組）鏈接：https://share.weiyun.com/5uXwz15

6. From single-cell RNA-seq to transcription network：2018年7月30日，主講人：李響（謝曉亮組）鏈接：https://share.weiyun.com/5ys73Yp。主要講述了WGCNA加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用。

7. 定制單細胞擴增與泛組學(xué)測序：2018年8月13日，主講人：宋立陽（謝曉亮組）鏈接：https://share.weiyun.com/5TMLNAk (單細胞擴增技術(shù)的比較)

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