液滴型單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)比較（二）
三種液滴型方法采用相似的技術(shù)生成液滴，采用barcode標(biāo)記細(xì)胞，應(yīng)用UMI進(jìn)行偏好校正。但它們?cè)赽eads的 、barcode的設(shè)計(jì)、cDNA擴(kuò)增等不同。
10X和inDrop采用水凝膠beads，因此引物可以固定在beads里面，而Drop-seq的引物只能固定在beads表面。包裹到液滴后，10X的beads發(fā)生溶解，引物釋放到溶液中可以提高mRNA的捕獲效率。inDrop使用紫外誘導(dǎo)的切割技術(shù)釋放引物。而DropSeq的引物不能從beads釋放，會(huì)降低其mRNA捕獲效率。
inDrop和10X的反轉(zhuǎn)錄等過(guò)程都在液滴內(nèi)進(jìn)行，有利于提高效率和降低試劑消耗。inDrop采用體外轉(zhuǎn)錄方式進(jìn)行擴(kuò)增，需要時(shí)間比較久。
單細(xì)胞里面兩個(gè)最重要的序列標(biāo)示。
液滴型scRNA-seq方法中只有一小部分的液滴包含珠狀物和一個(gè)完整細(xì)胞。然而生物實(shí)驗(yàn)不會(huì)那么理想，有些RNA會(huì)從死細(xì)胞或破損細(xì)胞中漏出來(lái)。所以沒(méi)有完整細(xì)胞的液滴有可能捕獲周?chē)h(huán)境游離出的少了RNA并且走完測(cè)序環(huán)節(jié)出現(xiàn)在最終測(cè)序結(jié)果中。液滴大小、擴(kuò)增效率和測(cè)序環(huán)節(jié)中的波動(dòng)會(huì)導(dǎo)致“背景”和真實(shí)細(xì)胞最終獲得的文庫(kù)大小變化很大，使得區(qū)分哪些文庫(kù)來(lái)源于背景哪些來(lái)源于真實(shí)細(xì)胞變得復(fù)雜。
大多數(shù)方法使用每個(gè)barcode對(duì)應(yīng)的總分子數(shù)(如果是UMI)或總reads數(shù)的分布來(lái)尋找一個(gè)“break point”區(qū)分來(lái)自于真實(shí)細(xì)胞的較大的文庫(kù)和來(lái)自于背景的較小的文庫(kù)。
CellRanger假設(shè)真實(shí)細(xì)胞文庫(kù)大小變化在10倍以內(nèi)，用期望的細(xì)胞數(shù)目估計(jì)區(qū)間的分布。
單細(xì)胞預(yù)測(cè)Doublets軟件包匯總|過(guò)渡態(tài)細(xì)胞是真的嗎？
因?yàn)椴捎玫氖墙跬|(zhì)性的細(xì)胞和持家基因，認(rèn)為具有最小噪音的基因集的變化分布與其它基因類(lèi)似，因此可以認(rèn)為細(xì)胞總的變化反應(yīng)了技術(shù)噪音的水平。技術(shù)噪音采用spearman correlation分析，相似值越小說(shuō)明技術(shù)噪音越大。而且分別用UMI和readscount做了評(píng)估，10X數(shù)據(jù)兩個(gè)評(píng)估結(jié)果類(lèi)似，InDrop技術(shù)UMI的技術(shù)噪音小一些。
基因水平的技術(shù)變化可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的UMI的變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)進(jìn)行評(píng)估。總體來(lái)看，高表達(dá)基因?qū)︻~CV值小，有更小的技術(shù)噪音。10X技術(shù)技術(shù)噪音依然最小。值得注意的是，一些最高表達(dá)的基因噪音水平卻比較高，右上的這些點(diǎn)。查看了下，主要是各個(gè)細(xì)胞里面最高表達(dá)的基因或線粒體基因，高的噪音可能來(lái)源于轉(zhuǎn)錄隨機(jī)性。
10X單細(xì)胞測(cè)序分析軟件:Cell ranger，從拆庫(kù)到定量
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