蛋白質(zhì)組學研究概述

作者簡介：中科院遺傳與發(fā)育生物學研究所中丹學院博士生張澤宇，外號 “大神”，口號 “Now you see me”。

這是其剛入學時做的一個報告。

本篇介紹下蛋白質(zhì)組學，如果覆蓋度深的話，應該是新時代的寵兒了。

古希臘，一個神一樣的存在，不只有雅典娜，更孕育了“ome”等一批高大上的詞匯。組學表示一組物質(zhì)整體的表現(xiàn)。蛋白質(zhì)組學表示特定系統(tǒng)內(nèi)蛋白質(zhì)集合的研究。

蛋白質(zhì)組學有基于二維凝膠分離 (2D-Gel)和質(zhì)譜鑒定技術。

2D-Gel根據(jù)蛋白的等電點和分子質(zhì)量的差異，通過等點聚焦和SDS-PAGE分離，通過染色和成像把不同電性和大小的蛋白質(zhì)顯示在凝膠上。

點的密度、大小、位置不同可以定性查看有無和相對定量地查看豐度差異。

chromatography 層析、色譜，(graphy也來源于希臘文，意為寫)。攜帶樣品的流動相穿過固定相時，由于樣品各組分理化性質(zhì)存在差異，與固定相作用力弱的組分，移動速度快；反之，移動速度慢。根據(jù)不同的保留時間，收集特定屬性的樣品進行進一步分析。根據(jù)流動相的不同又分為氣相色譜和液相色譜。

高效液相色譜，又稱為高壓液相色譜，高速液相色譜。流動相為液體，在高壓作用下快速流過固定相，分離效能高，靈敏度高，應用范圍廣，柱子可反復使用。最早洗脫出的是越親水的。

質(zhì)譜是測量離子質(zhì)荷比的分析方法，基本原理是使待測樣品中的組分在離子源中離子化，經(jīng)過電場加速形成離子束，進入質(zhì)量分析器，獲得質(zhì)譜圖。與Uniprot數(shù)據(jù)庫比較，得到對應的蛋白定量。

常用離子源有：基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）；電噴霧電離（ESI）。

飛行時間質(zhì)譜 (TOF)，分析物的質(zhì)荷比是根據(jù)分析物在真空飛行管中的飛行時間推算出的。飛行時間質(zhì)譜的質(zhì)量分析器由調(diào)制區(qū)、加速區(qū)、無場飛行空間和檢測器等部分組成。樣品分子電離以后，將離子加速并通過一個無場區(qū)，不同質(zhì)量的離子具有不同的能量，通過無場區(qū)的飛行時間長短不同，可以依次被收集檢測出來。

四極桿 (Quadrupole，Q)質(zhì)譜儀，從單級四極桿到三級四極桿, 功能越來越強。第一級四極桿選母離子，第二級四極桿作為碰撞室對母離子進行碰撞解離，第三級四極桿作為質(zhì)量分析器完成離子分析。三級四極桿采集到的MS/MS質(zhì)譜圖信息量大，并且較少發(fā)生重排反應，因而四極桿的質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量要高于離子阱串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

離子阱 (Orbitrap)質(zhì)譜儀，串聯(lián)質(zhì)譜儀，在分析前先將離子聚集儲存，離子阱是該儀器的核心部分，既可以作為碰撞室，又可以作為質(zhì)量分析器。分為線性離子阱和三維離子阱。線性離子阱具有更大的離子容量和掃描速度。

蛋白質(zhì)組實驗流程文字和圖形總結

定性蛋白質(zhì)組學

從樣品中分析全蛋白，胰蛋白酶消化成多肽，經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜檢測，比較實際檢測到的質(zhì)荷比和理論預測的質(zhì)荷比，鑒定蛋白的種類。

離子的屬性和質(zhì)量不同會產(chǎn)生不同的質(zhì)量指紋圖譜。

若多肽的氨基酸組成一樣，但順序不同，如何區(qū)分？

串聯(lián)質(zhì)譜，先獲得小肽的質(zhì)量；再將肽離子誘導碰撞碎裂成更小的碎片離子，獲得二級質(zhì)譜圖譜。

不同的片段化方式會得到不同的片段

MASCOT軟件搜庫鑒定蛋白

鑒定蛋白翻譯后修飾

磷酸化肽段富集 （類比于ChIP中的富集和Input）

定量蛋白質(zhì)組學

Label free相對定量，蛋白的量與Peak強度正相關。

酶解標記法, 酶解時加入H₂¹⁸O，可以在肽段C端加2個重氧原子。

iTRAQ 技術采用4種或8種同位素編碼的標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團，而后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量或絕對含量。

SILAC: 兩組細胞同時培養(yǎng)，A組是在包含正常氨基酸（light）的培養(yǎng)基中；B組的培養(yǎng)基則含有“重型（heavy）”的氨基酸，即穩(wěn)定同位素標記的氨基酸。最初SILAC使用的標記氨基酸是氚代甲硫氨酸和氘代甘氨酸，目前常用的標記氨基酸有亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸等。細胞傳代若干代后，穩(wěn)定同位素標記的氨基酸完全摻入到蛋白中，取代了原有的氨基酸。這樣，兩個蛋白之間就存在分子量的改變，而其它化學性質(zhì)無異。

現(xiàn)存技術的缺點

靶向蛋白質(zhì)組技術主要包括SRM/MRM和PRM兩種方法。SRM/MRM （Selected/ Multiple reaction monitoring）使用的是三重四級桿的質(zhì)譜，利用四級桿高選擇性的特點對母離子和子離子依次進行分選。

PRM（Parallel reaction monitoring）技術，該技術結合了四級桿的高選擇性以及Orbitrap的高分辨、高精度特性，能夠?qū)Χ増D譜進行獨立的鑒定，方法流程更加便捷。與傳統(tǒng)的SRM/MRM相比，PRM在復雜背景下具有更優(yōu)秀的抗干擾能力和檢測靈敏度。

同源搜索或結合轉錄組數(shù)據(jù)解決注釋缺失的問題

總結

Ref:

1. http://www.360doc.com/content/15/0529/20/11644963_474287763.shtml

2. http://tech.sina.com.cn/roll/2017-06-05/doc-ifyfuzym8006769.shtml

3. https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/protein-biology/protein-mass-spectrometry-analysis/protein-quantitation-mass-spectrometry/silac-metabolic-labeling-systems.html

4. https://baike.baidu.com/item/%E5%90%8C%E4%BD%8D%E7%B4%A0%E6%A0%87%E8%AE%B0%E7%9B%B8%E5%AF%B9%E5%92%8C%E7%BB%9D%E5%AF%B9%E5%AE%9A%E9%87%8F/12756990?fr=aladdin&fromid=347038&fromtitle=iTRAQ

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