空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)

星系探索。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域，空間轉(zhuǎn)錄組也開(kāi)辟了新世界。Credit: bjdlzx/Getty Images

Nature Methods在今年1月份將空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)評(píng)價(jià)為2020年度方法，空間轉(zhuǎn)錄組方法最近今年越來(lái)越受到歡迎，它將帶領(lǐng)組學(xué)在生物學(xué)的研究上進(jìn)入新的階段。從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序到實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄測(cè)序，這一過(guò)程為精確認(rèn)識(shí)不同細(xì)胞類(lèi)型提供了巨大的幫助?，F(xiàn)在，新的空間轉(zhuǎn)錄組方法不僅帶來(lái)轉(zhuǎn)錄組信息，同時(shí)還提供空間信息，幫研究者更好辨別轉(zhuǎn)錄的位置，進(jìn)一步擴(kuò)展到單細(xì)胞分辨率，這會(huì)更大程度提升科學(xué)家對(duì)單個(gè)細(xì)胞的認(rèn)識(shí)和解讀。這個(gè)過(guò)程中涌現(xiàn)了一大批新的技術(shù)方法，新的成像技術(shù)以及把相關(guān)科研成果轉(zhuǎn)化的生物技術(shù)公司，面臨的挑戰(zhàn)也是巨大的，尤其是如何處理產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，如何更好的提升現(xiàn)有方法讓更多的人在自己的實(shí)驗(yàn)室去實(shí)現(xiàn)，如何把這些技術(shù)商業(yè)化等。作者通過(guò)與不同的人的交流訪談，對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行了深切解讀。

首先我們需要為大量 RNA 測(cè)序準(zhǔn)備樣本，其中組織被均質(zhì)化并分析以產(chǎn)生組織細(xì)胞中 mRNA 的平均基因表達(dá)——稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄組。之后開(kāi)發(fā)單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq) ，對(duì)每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行更精細(xì)的評(píng)估。在 scRNA-seq 中，研究人員將細(xì)胞從組織中脫離出來(lái)，從而可以根據(jù)基因表達(dá)來(lái)辨別細(xì)胞類(lèi)型。艾倫腦科學(xué)研究所（Allen Institute for Brain Science）所長(zhǎng)Hongkui Zeng說(shuō)，處理單個(gè)細(xì)胞更像是在研究水果沙拉（fruit salad）而不是冰沙（smoothie）?，F(xiàn)在，通過(guò)空間解析轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，科學(xué)家可以獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并了解這些細(xì)胞在組織中的空間位置。曾與Zeng共同接受采訪的艾倫研究所研究員 Bosiljka Tasic 說(shuō)：“水果餡餅（fruit tart）才是是空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（不是水果沙拉），你確切地知道每塊水果的位置以及各水果之間的關(guān)系?！笨紤]到人們可以從單個(gè)細(xì)胞和空間分辨細(xì)胞中學(xué)到多少東西，“smoothie”方法（RNAseq）很快就過(guò)時(shí)了。空間分析提供所有細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息還不是常規(guī)做法，該領(lǐng)域正在朝著單細(xì)胞方向快速發(fā)展?？_林斯卡學(xué)院（Karolinska Institute）生物學(xué)家 Sten Linnarsson 說(shuō)，“一切都與空間有關(guān)。空間單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)是單細(xì)胞分析之后的下一波浪潮，對(duì)于研究人類(lèi)疾病的實(shí)驗(yàn)室特別有用，人類(lèi)疾病通常始于單細(xì)胞并在空間上傳播。我想，幾年后我們將在活體組織中進(jìn)行空間單細(xì)胞組學(xué)實(shí)驗(yàn)，”這將單細(xì)胞發(fā)展帶入一個(gè)完整的循環(huán)。

熱衷于在空間位置中量化 mRNA 的實(shí)驗(yàn)室采用了一系列方法，這些方法可在神經(jīng)科學(xué)、癌癥研究或發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域提供空間解析的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。“我認(rèn)為未來(lái)是光明的，”華盛頓大學(xué)（University of Washington）的 Jay Shendure 說(shuō)，他最興奮的是如何應(yīng)用這些方法來(lái)獲得結(jié)合細(xì)胞狀態(tài)、歷史和命運(yùn)的空間解析發(fā)育圖譜。這是一個(gè)非?；钴S的領(lǐng)域，這種技術(shù)開(kāi)辟了新的實(shí)驗(yàn)機(jī)會(huì)。哈佛大學(xué)（Harvard University）的Xiaowei Zhuang，同時(shí)也是霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所（Howard Hughes Medical Institute）研究員，一直致力于影像學(xué)的研究。她和她的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)了一種超分辨率顯微鏡方法，即隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡 (STORM)[備注：隨機(jī)光學(xué)重建顯微法(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM) 是一種將熒光光譜和顯微分析技術(shù)應(yīng)用于單個(gè)分子之上的嶄新的物理手段，其是一種比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡高10倍以上分辨率的新型顯微技術(shù)] 。

當(dāng)單細(xì)胞基因組學(xué)出現(xiàn)時(shí)，Zhuang致力于將成像和基因組學(xué)結(jié)合起來(lái)，以“獲得兩全其美”。從物理學(xué)家轉(zhuǎn)為生物學(xué)家的烏得勒支研究所（Hubrecht Institute）研究員Alexander van Oudenaarden 說(shuō)，方法，尤其是從 2012 年左右開(kāi)始出現(xiàn)的用于在單細(xì)胞序列捕獲空間信息的方法，已經(jīng)融合了以前獨(dú)立的成像、測(cè)序和分子表征。他和他的實(shí)驗(yàn)室結(jié)合了單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)來(lái)比較原腸胚和小鼠胚胎中的基因表達(dá)。對(duì)單細(xì)胞的研究起源于 19 世紀(jì)，例如 Rudolf Virchow 觀察到的疾病始于細(xì)胞，而不是整個(gè)生物體。十年前，當(dāng) van Oudenaarden 和其他人通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞在生長(zhǎng)的生物體中的發(fā)育、生長(zhǎng)和遷移時(shí)，“我們總是有點(diǎn)嫉妒測(cè)序的世界?！彼退膱F(tuán)隊(duì)可以制作延時(shí)影相并捕捉復(fù)雜的過(guò)程，但只能用少量熒光蛋白標(biāo)記基因表達(dá)?；蚪M學(xué)實(shí)驗(yàn)室可以測(cè)量數(shù)千個(gè)基因。為了在組織水平做到這一點(diǎn)，他們“將它們放入攪拌機(jī)中”。現(xiàn)在可以評(píng)估許多單個(gè)細(xì)胞和許多基因并跟蹤細(xì)胞的組織環(huán)境、它們的空間屬性。現(xiàn)在有各種聰明的方法來(lái)保存空間信息，這是一項(xiàng)非常令人興奮的技術(shù)。

瑞典的研究人員開(kāi)發(fā)了一種方法，對(duì)固定的染色組織進(jìn)行成像、透化，然后將 mRNA 附著到一系列帶條形碼的寡核苷酸上。RNA 被逆轉(zhuǎn)錄cDNA，對(duì)cDNA 進(jìn)行測(cè)序并產(chǎn)生空間解析的轉(zhuǎn)錄組信息。Credit: Adapted with permission from ref. 4, AAAS

正如來(lái)自 KTH 皇家理工學(xué)院生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室的 Joakim Lundeberg 及其同事所指出的，空間技術(shù)可以分為涉及對(duì)顯微解剖組織進(jìn)行基因表達(dá)分析的技術(shù)，以及涉及原位雜交、原位測(cè)序、原位捕獲和空間數(shù)據(jù)的重構(gòu)。Zeng說(shuō)，單分子熒光原位雜交 (smFISH) 是帶有空間技術(shù)的雜交方法的開(kāi)端”。在這種方法中，多個(gè)寡核苷酸攜帶熒光標(biāo)記并與 RNA 分子結(jié)合。來(lái)自艾倫研究所、生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室和卡羅林斯卡研究所的研究人員指出，smFISH檢測(cè)靈敏度接近 100%。

來(lái)自 KTH 的 Patrik St?hl 解釋說(shuō)，大約在 2009 年，卡羅林斯卡學(xué)院的研究員 Jonas Frisén 著手研究如何從典型的組織切片中獲取更多信息，這些切片是用可追溯到 19 世紀(jì)的染色劑制備的切片。Frisén 聯(lián)系了 KTH 的同事 Lundeberg，St?hl 是他的博士生。Fredrik Salmén 是 KTH 的一名碩士生；St?hl 后來(lái)加入 Frisén 實(shí)驗(yàn)室擔(dān)任博士后研究員，Salmén 成為 Lundeberg 實(shí)驗(yàn)室的博士生。St?hl 和 Salmén 的一個(gè)合作項(xiàng)目產(chǎn)生了一種空間分析方法，通過(guò)該方法對(duì)固定的染色組織進(jìn)行成像，然后進(jìn)行透化，釋放的 mRNA 移動(dòng)并附著在組織下方的陣列上，帶有條形碼的寡核苷酸，將它們固定在組織中的位置。逆轉(zhuǎn)錄后，組織被酶促反應(yīng)去除，剩下的是連接到寡核苷酸陣列的空間條形碼cDNA 分子，接下來(lái)是對(duì)這些 cDNA 的測(cè)序，其中位置條形碼提供空間解析的轉(zhuǎn)錄組信息?？茖W(xué)家們想將此技術(shù)在單個(gè)細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)?！拔覀冋娴暮芟脒_(dá)到那個(gè)水平，”Salmén 說(shuō)，他與 St?hl 共同接受了采訪，他現(xiàn)在是 van Oudenaarden 實(shí)驗(yàn)室的博士后研究員。該方法的分辨率最終為 100 μm，即數(shù)十個(gè)細(xì)胞。Salmén 說(shuō)，他們面臨的眾多技術(shù)挑戰(zhàn)之一是 mRNA 可以向多個(gè)方向擴(kuò)散，這可能會(huì)導(dǎo)致空間數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確或混合表達(dá)模式。他們開(kāi)發(fā)了避免這種情況的方法。“這是一場(chǎng)漫長(zhǎng)的斗爭(zhēng)，”St?hl 說(shuō)，但他們的團(tuán)隊(duì)成功了，St?hl 和 Salmén 共同成為論文的第一作者。St?hl 說(shuō)，這篇論文和過(guò)程塑造了他們的科學(xué)和他們的職業(yè)生涯。

St?hl 說(shuō)，Salmén 的關(guān)鍵想法是建立與熒光核苷酸的初始反應(yīng)，使細(xì)胞的mRNA與陣列表面探針相遇的位置可見(jiàn)。St?hl 說(shuō)，這讓您可以準(zhǔn)確地想象捕獲的 mRNA 合成 cDNA 的位置。“你會(huì)得到一個(gè)非常好的熒光足跡，顯示所有東西的去向，對(duì)我們來(lái)說(shuō)，這是讓其他人開(kāi)始工作的巨大基石，”他說(shuō)。Salmén 笑著說(shuō)，這個(gè)基石讓許多人相信這種方法具有潛力——即使是“非信徒”。他表示，方法開(kāi)發(fā)意味著很多失敗。該方法通過(guò)Spatial Transcriptomics 公司商業(yè)化，該公司于 2018 年被 10x Genomics 收購(gòu)，從而產(chǎn)生了產(chǎn)品 Visium。

空間技術(shù)通過(guò)定位表達(dá)的基因來(lái)幫助構(gòu)建圖譜。在這里，seqFISH+ 用于測(cè)量小鼠皮層中的 10,000 個(gè)基因。Credit: Cai lab, Caltech, I. Strazhnik; adapted with permission from ref. 6, Springer Nature.

加州理工學(xué)院（California Institute of Technology）研究員 Long Cai 說(shuō)，成像本質(zhì)上是空間的，而且是原生的 3D ，他的職業(yè)生涯也受到空間方法的影響。他說(shuō)，要使用顯微鏡獲得 3D 信息，“您只需進(jìn)行切片”。他回憶起他的加州理工學(xué)院同事芭芭拉·沃爾德 (Barbara Wold) 向他提到 RNA 測(cè)序可以提供多么豐富的信息。那是十年前，第二代測(cè)序技術(shù)剛剛興起?！白屑?xì)想想，測(cè)序?qū)嶋H上是一個(gè)盒子里的單分子成像”，他說(shuō)，“測(cè)序儀可以產(chǎn)生 200 個(gè)堿基對(duì)的讀數(shù)，這些讀數(shù)來(lái)自 200 輪化學(xué)反應(yīng)和成像”。基因組學(xué)方法產(chǎn)生細(xì)胞信息，但與 smFISH 相比，通過(guò)成像讀取單細(xì)胞基因組信息需要更多的標(biāo)簽。Cai 應(yīng)用超分辨率顯微鏡將可辨別的熒光點(diǎn)填充到成像細(xì)胞中。這些點(diǎn)可以是標(biāo)記 RNA、DNA 或蛋白質(zhì)。他實(shí)驗(yàn)室的方法 seqFISH5 和 seqFISH+ 使用一系列帶有熒光團(tuán)的 FISH 探針對(duì) mRNA 進(jìn)行連續(xù)輪次雜交，轉(zhuǎn)錄物固定在細(xì)胞中。在每一輪雜交中，探針都被去除，便于下一輪與不同熒光團(tuán)的雜交，熒光信號(hào)序列提供空間解析的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。他說(shuō)，“您可以直接原位完成，而不是將成像信息轉(zhuǎn)換為測(cè)序讀數(shù)?！彼麆?chuàng)立了一家名為 Spatial Genomics 的初創(chuàng)公司，旨在將 seqFISH 商業(yè)化。

在他看來(lái)，研究人員需要達(dá)到單細(xì)胞分辨率，scRNA-seq 提供了單細(xì)胞分辨率，但到目前為止，組織成像還沒(méi)有。分辨率很重要，因?yàn)樵谝粋€(gè)感興趣的區(qū)域，組織可能有多種細(xì)胞類(lèi)型，但如果沒(méi)有足夠的轉(zhuǎn)錄組分辨率，就會(huì)出現(xiàn)“完全錯(cuò)誤的圖片”。如果一種方法效率低下，可能會(huì)遺漏一些信號(hào)，例如以 10 個(gè)或更少拷貝表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的 mRNA。Cai認(rèn)為當(dāng)前許多空間方法的弱點(diǎn)是它們導(dǎo)致“最終你必須放入測(cè)序儀”。高通量基因組學(xué)已經(jīng)有了一個(gè)良好的開(kāi)端，對(duì)于測(cè)序現(xiàn)在可以做的幾乎所有事情，都會(huì)有一種空間分析方法可以做同樣的事情甚至做得更好。

博德研究所（Broad Institute）的醫(yī)師兼科學(xué)家埃文·馬科斯科 (Evan Macosko) 一直熱衷于使用基因組學(xué)對(duì)細(xì)胞和組織進(jìn)行新型測(cè)量。他在哈佛醫(yī)學(xué)院 Steve McCarroll 實(shí)驗(yàn)室擔(dān)任博士后時(shí)共同開(kāi)發(fā)了Drop-seq[備注：一種scRNAseq建庫(kù)方法]。使用 Drop-seq，準(zhǔn)備數(shù)千個(gè)測(cè)序文庫(kù)需要一天的時(shí)間。在微流體裝置中，細(xì)胞穿過(guò)狹窄的通道，最終被包裹在一個(gè)帶有珠子的液滴中，每個(gè)珠子都配備了一個(gè)獨(dú)特的 12 堿基對(duì)寡核苷酸條形碼。細(xì)胞在液滴中裂解，mRNA 被編碼并逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，然后進(jìn)行測(cè)序。Macosko 與時(shí)任 Broad 研究員的 Fei Chen 一起開(kāi)發(fā)了 Slide-seq，后者共同發(fā)明了膨脹顯微鏡，現(xiàn)在在 Broad 擁有一個(gè)實(shí)驗(yàn)室。Macosko 說(shuō)，該方法借鑒了“DNA 條形碼策略和其他一些技巧”。隨著 smFISH 的發(fā)展，該技術(shù)成為他實(shí)驗(yàn)室的主力軍。多重原位雜交策略很有用，但需要時(shí)間和技術(shù)?！斑@不是傳統(tǒng)分子生物學(xué)或細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室可以立即建立起來(lái)的，”他說(shuō)，他尋求一種不同的方法，利用基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室中基于 Illumina 的測(cè)序的廣泛基礎(chǔ)設(shè)施，在全基因組范圍內(nèi)獲得細(xì)胞或近細(xì)胞分辨率。他的團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用了 Drop-seq 的條形碼方案，從 50 微米的珠子開(kāi)始，然后轉(zhuǎn)向 10 微米的珠子。Macosko 說(shuō)，Chen 實(shí)驗(yàn)室的 Sam Rodriques 和 Macosko 實(shí)驗(yàn)室的 Robert Stickels 想出了如何將珠子單層排列為二維陣列，并開(kāi)發(fā)了一種將 RNA 轉(zhuǎn)移到珠子的方案，這說(shuō)起來(lái)容易做起來(lái)難。Slide-seq 的輸出接近單細(xì)胞分析的輸出，這使得使用單細(xì)胞計(jì)算工具成為可能。他們已經(jīng)運(yùn)行了單細(xì)胞分析工具在一些項(xiàng)目中，如 velocyto 和 Monocle，他們使用這種方法研究了晶狀體和胚胎皮層的發(fā)育。較低分辨率的空間技術(shù)每個(gè)像素有太多的細(xì)胞，這使得去卷積更加困難。由于 Slide-seq 使用珠子，可以繼續(xù)使珠子更小，分辨率更高。該團(tuán)隊(duì)一直致力于提高該方法的效率，Slide-seq v2 的 mRNA 捕獲效率接近 scRNA-seq 技術(shù)。效率很重要，因?yàn)閷?duì)于稀少的轉(zhuǎn)錄需要足夠的信息來(lái)準(zhǔn)確地將它們分配到特定位置。另外，關(guān)于將 Slide-seq 商業(yè)化的討論還處于早期階段。

莊小偉開(kāi)發(fā)了超分辨率顯微鏡方法STORM。單細(xì)胞基因組學(xué)讓她想到了將基因組學(xué)和成像融合起來(lái)。Credit: Harvard University

約翰霍普金斯大學(xué)(Johns Hopkins University)計(jì)算癌癥生物學(xué)家 Elana Fertig 說(shuō)，盡管在理想的世界中，她想要達(dá)到單細(xì)胞分辨率，但事實(shí)上，它不能完美地解析每個(gè)細(xì)胞。她致力于研究腫瘤異質(zhì)性，空間技術(shù)可以幫助解決這些問(wèn)題。她的一個(gè)項(xiàng)目研究 T 細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤，該項(xiàng)目專(zhuān)注于多組學(xué)，整合來(lái)自不同模式的數(shù)據(jù)，研究人員使用來(lái)自不止一種空間分析方法的數(shù)據(jù)。她發(fā)現(xiàn) 10x Genomics 的 Visium 技術(shù)比 FISH 更容易獲得。分子變化可以定義腫瘤類(lèi)型，但這些類(lèi)別中的腫瘤可能差異很大。“細(xì)胞類(lèi)型不是那么二元的【備注：這里她想表達(dá)細(xì)胞種類(lèi)遠(yuǎn)比想象的復(fù)雜的多】，”她說(shuō)，“她想知道迄今為止流式細(xì)胞術(shù)是否已經(jīng)塑造了細(xì)胞分型?！睂?duì)于這項(xiàng)工作，團(tuán)隊(duì)合作在開(kāi)發(fā)數(shù)據(jù)分析和可視化方法方面變得越來(lái)越重要。Fertig 實(shí)驗(yàn)室是美國(guó)國(guó)家癌癥研究所癌癥研究信息技術(shù)計(jì)劃的一部分，旨在構(gòu)建用于解釋越來(lái)越多地包含空間數(shù)據(jù)的多維組學(xué)數(shù)據(jù)的框架。隨著每個(gè)細(xì)胞有更多的標(biāo)記，數(shù)據(jù)的高維度增加了數(shù)據(jù)解釋的挑戰(zhàn)。“我認(rèn)為這是空間領(lǐng)域目前面臨的挑戰(zhàn)，”她說(shuō)。為了整合成像和單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄分析，她和她的團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用遷移學(xué)習(xí)來(lái)疊加基因相關(guān)特征并進(jìn)行降維。

Macosko 預(yù)設(shè)了一個(gè)圍繞尋找空間可變基因或?qū)ふ依每臻g信息的軌跡計(jì)算開(kāi)發(fā)方案。盡管付出了很多努力，但Shendure 表示，管理數(shù)據(jù)和跨平臺(tái)集成仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都會(huì)產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)，研究人員面臨著關(guān)于保存什么和丟棄什么的決定，并且不想偏離基因組學(xué)中開(kāi)放數(shù)據(jù)共享的原則。

空間解析轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了在基于干細(xì)胞的發(fā)育模型中表達(dá)的體節(jié)發(fā)生標(biāo)記，如圖在小鼠中。Credit: A. van Oudenaarden, Hubrecht Inst.

在艾倫研究所，大腦中的細(xì)胞分型等大規(guī)模項(xiàng)目與處理大型數(shù)據(jù)集一樣司空見(jiàn)慣。Tasic 說(shuō)，這甚至讓他們感到驚訝，當(dāng)查看每個(gè)細(xì)胞具有數(shù)萬(wàn)個(gè)屬性的單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時(shí)，他們能以多快的速度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)分析的界限。數(shù)據(jù)矩陣變得難以管理，他們與處理大規(guī)模數(shù)據(jù)矩陣的生物學(xué)之外的其他人合作。未來(lái)的計(jì)算之路既艱巨又令人興奮。他在研究生院“測(cè)量所有單細(xì)胞中所有基因”的夢(mèng)想開(kāi)始實(shí)現(xiàn)。除了數(shù)據(jù)大小和維度之外，Zeng 說(shuō)，他和他的團(tuán)隊(duì)致力于集成和校正批量效應(yīng)。即使使用相同模式捕獲的數(shù)據(jù)也可能會(huì)因批次而略有不同，因此必須進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了整合成像、測(cè)序和電生理學(xué)等模式，他們構(gòu)建了聚類(lèi)方法并利用了不同類(lèi)型的機(jī)器學(xué)習(xí)方法去嘗試。

空間技術(shù)可以揭示組織的復(fù)雜細(xì)胞類(lèi)型混合物——這里是小鼠大腦的嗅球。Credit: Cai lab, Caltech, I. Strazhnik Adapted with permission from ref. 6, Springer Nature.

van Oudenaarden 說(shuō)，存在很多機(jī)會(huì)，可以通過(guò)計(jì)算將scRNA-seq 和空間信息結(jié)合起來(lái)，將單細(xì)胞映射回空間，并構(gòu)建和使用參考圖譜。他對(duì)從原位雜交或不使用以前圖譜重建空間圖譜的計(jì)算方法很感興趣。一種這樣的方法，novoSpaRc，在沒(méi)有參考圖譜的情況下進(jìn)行“基因表達(dá)繪制圖譜”。它基于關(guān)于基因表達(dá)如何在組織切片中變化的假設(shè)。van Oudenaarden 說(shuō)，擁有更多關(guān)于組織的數(shù)據(jù)是一筆財(cái)富，這筆財(cái)富使得了解重要的“骨骼”（生物學(xué)的核心方面）成為“一個(gè)更大的難題”。對(duì)他來(lái)說(shuō)，單細(xì)胞組學(xué)和空間方法的結(jié)合“確實(shí)是一種產(chǎn)生無(wú)限可能的方式，但還需要使用單獨(dú)收集的數(shù)據(jù)來(lái)確認(rèn)和驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)。

空間技術(shù)有著悠久的歷史，Shendure 說(shuō)，例如在 Mats Nilsson、George Church 和其他人的實(shí)驗(yàn)室中，他們已經(jīng)在組織切片上直接進(jìn)行基因分型或測(cè)序等項(xiàng)目十多年了?？臻g分析在過(guò)去一兩年中蓬勃發(fā)展成為一個(gè)領(lǐng)域，部分是由于單細(xì)胞領(lǐng)域已經(jīng)成熟，并且技術(shù)已轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袕V泛用途的商業(yè)儀器。不過(guò)，還有一點(diǎn)仍然是挑戰(zhàn)之一，許多最令人興奮的方法仍然在某種程度上是定制的，比較局限，實(shí)際上其只能在一個(gè)或幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室中運(yùn)行。當(dāng)談到迄今為止的空間方法時(shí)，他說(shuō)，問(wèn)題是如何讓其他人更容易地采用這些方法，這些方法必須能夠大規(guī)模推廣。Zeng說(shuō)，科學(xué)家所做的大部分工作既困難又昂貴，但技術(shù)發(fā)展有助于改變這種狀況。Tasic 說(shuō)，商業(yè)化對(duì)于推動(dòng)單細(xì)胞測(cè)序至關(guān)重要，同樣的情況也可能發(fā)生在空間技術(shù)中，我非常期待能夠在單細(xì)胞水平上發(fā)揮作用的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的商業(yè)解決方案。

10x Genomics 研發(fā)高級(jí)副總裁 Michael Schnall-Levin 說(shuō)，空間技術(shù)，尤其是原位技術(shù)，在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域可能最先起飛。其他渴望空間分析的領(lǐng)域是發(fā)育生物學(xué)，人們研究細(xì)胞中分子的梯度和空間模式，以及癌癥研究，尤其是評(píng)估腫瘤異質(zhì)性和 T 細(xì)胞浸潤(rùn)。Schnall-Levin 表示，自公司成立以來(lái)，團(tuán)隊(duì)開(kāi)始使用微流體技術(shù)、長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序方法，并專(zhuān)注于單細(xì)胞和空間分析。最初與 Spatial Transcriptomics 達(dá)成的潛在聯(lián)合營(yíng)銷(xiāo)協(xié)議在 2018 年變成了一項(xiàng)收購(gòu)。Visium 還達(dá)不到單細(xì)胞分辨率，但該公司正在努力實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。Schnall-Levin 說(shuō)，他和他的團(tuán)隊(duì)還專(zhuān)注于基于原位的高分辨率分析。該公司收購(gòu)了哈佛醫(yī)學(xué)院 Church 實(shí)驗(yàn)室的衍生產(chǎn)品 ReadCoor 和斯德哥爾摩大學(xué)實(shí)驗(yàn)室和生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究員 Mats Nilsson 的衍生產(chǎn)品 Cartana。Cartana 使用掛鎖探針與目標(biāo)基因的 mRNA 雜交，然后進(jìn)行滾環(huán)PCR以原位擴(kuò)增 RNA，為測(cè)序做準(zhǔn)備。ReadCoor 也使用條形碼和探針進(jìn)行熒光原位 RNA 測(cè)序和蛋白質(zhì)檢測(cè)。Schnall-Levin 說(shuō)，Cartana 為 10x Genomics 帶來(lái)了知識(shí)產(chǎn)權(quán)組合和具有專(zhuān)業(yè)知識(shí)的科學(xué)家，這是一種可以加速研究的資源。ReadCoor 帶來(lái)了科學(xué)家、一項(xiàng)“基礎(chǔ)技術(shù)”、知識(shí)產(chǎn)權(quán)和技術(shù)開(kāi)發(fā)，因?yàn)橹圃靸x器公司的團(tuán)隊(duì)已經(jīng)克服了一些“非平凡”的工程限制。10x Genomics 的顧問(wèn) Shernaz Daver 說(shuō)，在兩家公司之間，10x 獲得了 110 項(xiàng)專(zhuān)利，導(dǎo)致公司總共擁有 935 項(xiàng)專(zhuān)利。Schnall-Levin 說(shuō)，這些技術(shù)能夠?qū)⒎肿泳_定位到亞細(xì)胞位置。目前，他們測(cè)量了幾百個(gè)基因的集合，但顯然，它們還有增長(zhǎng)的空間。他認(rèn)為 ReadCoor 和 Cartana 的方法是對(duì)支持 Visium 的技術(shù)的補(bǔ)充。該公司在收購(gòu)后與學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室保持聯(lián)系，因?yàn)樗麄儞碛泻苤匾膶?zhuān)業(yè)知識(shí)。

2019 年，nanoString 開(kāi)始銷(xiāo)售其用于空間分辨組織分析的儀器 GeoMx。該設(shè)備一直在與早期采用者進(jìn)行測(cè)試。一些實(shí)驗(yàn)室使用原型，另一些實(shí)驗(yàn)室將樣品發(fā)送到公司的西雅圖總部并遠(yuǎn)程使用該儀器?！拔覀儚闹袑W(xué)到了很多東西，”首席科學(xué)官兼研發(fā)高級(jí)副總裁 Joe Beechem 說(shuō)，“他們端著一杯酒坐在客廳里，控制著它，像小孩子一樣大笑。”早期，GeoMx 可以捕獲大約 100 個(gè) mRNA；nanoString 總裁兼首席執(zhí)行官 Brad Gray 說(shuō)，現(xiàn)在這個(gè)數(shù)字已經(jīng)超過(guò) 22,000，這表明該領(lǐng)域的發(fā)展速很快。nanoString 作為西雅圖系統(tǒng)生物學(xué)研究所的衍生產(chǎn)品，擁有光學(xué)分子條碼技術(shù)是關(guān)于空間分析的。Beechem 說(shuō)，GeoMx 平臺(tái)的早期使用者主要是在免疫腫瘤學(xué)領(lǐng)域，例如，實(shí)驗(yàn)室試圖觀察 T 細(xì)胞是否被困在腫瘤的外圍，而不是將其破壞后深入其中。一天，就在演講之前，他在餐巾紙上草草寫(xiě)下了該公司的寡核苷酸條碼如何在空間上解析組織并在第二代測(cè)序儀上提供讀數(shù)，該公司此前曾開(kāi)發(fā)出一種將條形碼附加到帶有光可切割接頭的抗體的方法，他的想法是在組織載玻片上散布連接器和條形碼，寡核苷酸與 mRNA 雜交，顯微鏡拍攝組織快照，然后發(fā)出一束光，從光切割的接頭上彈出，然后對(duì) mRNA 和條形碼進(jìn)行測(cè)序。正如 Gray 解釋的那樣，他們的客戶長(zhǎng)期以來(lái)一直要求研究整個(gè)轉(zhuǎn)錄組并獲得更高分辨率到細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞器的方法，以便他們可以問(wèn)：“它是在表面上，還是在細(xì)胞核中，還是附著在某些細(xì)胞器上？”在他看來(lái)，市場(chǎng)將分為兩個(gè)儀器類(lèi)別。其一是諸如 GeoMx 和 Visium 之類(lèi)的分析器，它們以高通量查看感興趣的多細(xì)胞區(qū)域，然后是具有細(xì)胞和亞細(xì)胞分辨率的儀器，它們可能涵蓋也可能不涵蓋整個(gè)轉(zhuǎn)錄組，但每一次涵蓋數(shù)千個(gè)基因。nanoString 剛剛推出了具有單細(xì)胞分辨率的 GeoMx 數(shù)字空間剖面儀。Gray 知道 nanoString 的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手包括 Fluidigm 的 Hyperion 成像系統(tǒng)、成像質(zhì)量細(xì)胞計(jì)數(shù)器和 Ionpath 的 MIBIscope。新的 nanoString 技術(shù)還使用光可切割標(biāo)簽對(duì)組織進(jìn)行基因表達(dá)分析，包括福爾馬林固定的石蠟包埋組織。例如，它被用于研究死于 COVID-19 的人的尸檢樣本的空間分析方面。Beechem 說(shuō)，有了這種類(lèi)型的技術(shù)，研究人員將擁有他們過(guò)去擁有的所有分子工具的所有功能。

BGI Research 正在開(kāi)發(fā)一種用于空間分辨基因表達(dá)分析的高分辨率方法。BGI 集團(tuán)首席執(zhí)行官、BGI Research 負(fù)責(zé)人 Xun Xu 說(shuō)，這個(gè)想法是彌合單細(xì)胞測(cè)序和細(xì)胞在組織中所處位置的空間分析之間的差距，這兩者將共同塑造成功能和結(jié)構(gòu)的研究。他觀察了該領(lǐng)域的其他公司，并相信 BGI 方法將具有最高分辨率。Xu說(shuō)，該方法可以捕獲每個(gè)細(xì)胞數(shù)百個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，它作為納米陣列封裝在硅芯片上，采用半導(dǎo)體行業(yè)的光刻技術(shù)構(gòu)建而成。BGI 已經(jīng)使用這種方法來(lái)分析 DNA-蛋白質(zhì)相互作用，BGI Research 的科學(xué)家 Chris Ao Chen 說(shuō)，他和他的同事現(xiàn)在正在研究將細(xì)胞或組織嵌入這些芯片的方法，以產(chǎn)生高分辨率的空間解析數(shù)據(jù)。硅芯片陣列的隔間每個(gè)都有圓形區(qū)域，每個(gè)區(qū)域都包含可通過(guò)傳統(tǒng)寬場(chǎng)成像解析的條形碼 DNA 納米球。DNA 納米球是由捕獲的轉(zhuǎn)錄本制成的環(huán)狀 cDNA 束，包括準(zhǔn)備用于 BGI 基于陣列的測(cè)序的引物和接頭。每個(gè)條碼讀數(shù)都將陣列上的特定間距作為其空間地址。Xu說(shuō)，芯片上的追蹤線給出了在每個(gè)細(xì)胞中測(cè)量的坐標(biāo)?？臻g方法BGI 借鑒了從 Complete Genomics, Inc. 獲得的技術(shù)，預(yù)計(jì)將于 2021 年某個(gè)時(shí)候發(fā)布。BGI 已經(jīng)制造出用于小鼠大腦空間分析的芯片，每個(gè)納米球箱中約有 2,000 個(gè)基因和 4,000 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本。Xu說(shuō)，該團(tuán)隊(duì)正在考慮從 mRNA 到其他組學(xué)。最終，該儀器可以幫助研究人員構(gòu)建人類(lèi)和模型生物參考組織圖譜；他們可能會(huì)使用這種空間技術(shù)來(lái)評(píng)估遺傳變異如何影響組織功能，例如在癌癥中，或者將其用于跨物種比較，例如基于組織的進(jìn)化和器官結(jié)構(gòu)適應(yīng)性研究。

涉及空間領(lǐng)域的公司還有活躍的軟件開(kāi)發(fā)商。Schnall-Levin 表示，信息學(xué)一直是公司的核心部分，他的團(tuán)隊(duì)致力于開(kāi)源軟件。研究人員可以將他們的算法和工具添加到 10x Genomics 流程中。正如Xu解釋的那樣，該團(tuán)隊(duì)致力于開(kāi)發(fā)交互式可視化工具，讓人們能夠真實(shí)地了解組織。nanoString 的 Gray 說(shuō)：“Joe 最大的研發(fā)部門(mén)現(xiàn)在是軟件部門(mén)?！痹摴镜某绦騿T比分子生物學(xué)家和工程師還多。

使用 MERFISH，Zhuang實(shí)驗(yàn)室捕獲了人類(lèi)癌細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞中 10,050 個(gè)基因的表達(dá)。來(lái)自不同基因的 RNA 分子以不同的顏色顯示。Credit: X. Zhuang laboratory, Harvard U./HHMI

艾倫腦科學(xué)研究所所長(zhǎng)Hongkui Zeng（左）和同樣在艾倫研究所的 Bosiljka Tasic。Credit: Allen Institute for Brain Science

對(duì)于最近的小鼠初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層圖譜，研究小組指出，單細(xì)胞基因組學(xué)已經(jīng)應(yīng)用廣泛，包括神經(jīng)科學(xué)，并促進(jìn)了實(shí)驗(yàn)室從能夠?qū)Ρ硇瓦M(jìn)行分類(lèi)和描述到具有機(jī)械和解釋性分子遺傳框架的轉(zhuǎn)變。為了通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)細(xì)胞類(lèi)型繪制來(lái)自小鼠初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層的 300,000 多個(gè)細(xì)胞的空間組織圖，他們選擇了 Zhuang 的 MERFISH，即多重抗錯(cuò)熒光原位雜交。他們將 MERFISH 與其他方法（如 Patch-seq）相結(jié)合，其中細(xì)胞通過(guò)電生理學(xué)進(jìn)行測(cè)量然后測(cè)序。他們分析并比較了小鼠、狨猴和人類(lèi)轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞類(lèi)型，然后選擇了超過(guò) 250 個(gè)基因進(jìn)行成像，通過(guò)單細(xì)胞表達(dá)譜進(jìn)行聚類(lèi)，發(fā)現(xiàn)與通過(guò)單核和單細(xì)胞 RNA-seq 識(shí)別的聚類(lèi)非常吻合。這讓他們能夠辨別細(xì)胞類(lèi)型的空間分布，并獲得對(duì)傳統(tǒng)定義層進(jìn)行細(xì)化的皮質(zhì)層的視圖。他們還注意到沿內(nèi)側(cè)-外側(cè)和前后軸的空間分布。有時(shí)，關(guān)于大腦制圖的分歧會(huì)爆發(fā)，但 Tasic 相信先進(jìn)的技術(shù)將慢慢有助于解決這些分歧，這些分歧有時(shí)是基于使用不同方法的實(shí)驗(yàn)室。有了一個(gè)共同的坐標(biāo)系，分歧就可以轉(zhuǎn)移到關(guān)于功能的必要討論?！巴ǔＲ粋€(gè)基因不足以識(shí)別細(xì)胞類(lèi)型，”Zeng說(shuō)，“你有多個(gè)基因在多個(gè)不同的水平上表達(dá)，它們共同構(gòu)成了一個(gè)細(xì)胞。”觀察單個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的數(shù)千個(gè)基因的能力“已經(jīng)極大地改變了這個(gè)領(lǐng)域”。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)增加了豐富性，可能還沒(méi)有數(shù)以千計(jì)的基因，這取決于方法，但它的想法是相同的：研究人員以空間定位的方式了解細(xì)胞的許多基因。

Zhuang 很高興 MERFISH 被用于構(gòu)建腦圖譜?！拔覀€(gè)人對(duì)大腦非常著迷，”她說(shuō)。在 MERFISH 中，RNA 在雜交輪次中被編碼。非熒光靶向探針與 mRNA 結(jié)合，熒光讀出探針與靶向探針雜交，不同的條形碼。多輪次的雜交、條形碼和糾錯(cuò)使捕獲許多基因成為可能。然而，雜交輪次的挑戰(zhàn)是錯(cuò)誤的積累，莊說(shuō)。每一輪單獨(dú)的錯(cuò)誤率很小，但錯(cuò)誤累積并變得顯著，這有基因錯(cuò)誤識(shí)別的風(fēng)險(xiǎn)。smFISH 具有很高的準(zhǔn)確性，莊說(shuō)。但它是一次性測(cè)量，而不是累積誤差的連續(xù)測(cè)量。當(dāng)她和她的團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā) MERFISH 時(shí)，他們致力于成像、內(nèi)置糾錯(cuò)以及一種在數(shù)千種 RNA 物種轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)提供結(jié)果的方法?！斑@花了我們一段時(shí)間，”她說(shuō)。該方法實(shí)現(xiàn)了80%的檢測(cè)效率。在另一個(gè)基于 BICCN 的項(xiàng)目中，Zhuang和她的團(tuán)隊(duì)使用 MERFISH 分析了小鼠下丘腦視前區(qū)超過(guò)一百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。在以前沒(méi)有生過(guò)幼崽的雌性小鼠的大腦中，接觸幼崽會(huì)激活一個(gè)神經(jīng)元，這種神經(jīng)元在雌性和雄性小鼠父母中也被激活，但在沒(méi)有生育過(guò)一胎的雄性小鼠中則不活躍。她和她的團(tuán)隊(duì)還應(yīng)用 MERFISH 來(lái)表征亞細(xì)胞空間組織，以揭示不同細(xì)胞區(qū)室中的 RNA 以及染色質(zhì)的組織方式。最終，這項(xiàng)工作展示了“3D 基因組組織和轉(zhuǎn)錄是如何相互關(guān)聯(lián)的，”她說(shuō)。與哈佛醫(yī)學(xué)院研究員大衛(wèi)沃爾特和杰弗里莫菲特（她的前博士后研究員現(xiàn)在擁有自己的哈佛醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室）一起，她成立了一家名為 Vizgen 的公司，將 MERFISH 商業(yè)化。

作為一名顯微鏡專(zhuān)家，Zhuang很高興看到成像和單細(xì)胞基因組分析的領(lǐng)域越來(lái)越近。KTH 的 St?hl 期待高分辨率的空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)，“也許，像 10 微米這樣的單個(gè)細(xì)胞可能是最佳點(diǎn)，”他說(shuō)，它可以為每個(gè)像素提供足夠的數(shù)據(jù)。Zeng 對(duì)出現(xiàn)的空間分析技術(shù)感到高興。許多現(xiàn)有方法比如scRNAseq，它仍然為量化基因表達(dá)提供最高靈敏度的讀數(shù)。不過(guò)，有一天，他希望我們可以完全擺脫單細(xì)胞測(cè)序以進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組的單細(xì)胞空間分析。

空間信息顯然很重要，Shendure 說(shuō)，就人們可以想象的技術(shù)最終走向何方而言，我們?nèi)蕴幱谠缙陔A段。令人興奮的是，空間解析轉(zhuǎn)錄組學(xué)是年度最佳方法，Macosko 說(shuō)，我認(rèn)為這只是一個(gè)開(kāi)始。為了深入研究一個(gè)感興趣的問(wèn)題，人們可能會(huì)使用空間分析領(lǐng)域的眾多工具和技術(shù)中的幾種。標(biāo)準(zhǔn)、指標(biāo)和基準(zhǔn)將有助于空間領(lǐng)域，就像它們有助于單細(xì)胞基因組學(xué)領(lǐng)域一樣。

Macosko 說(shuō)，從單分子 FISH 和單細(xì)胞基因組分析開(kāi)始，已經(jīng)成為將基因組學(xué)的大規(guī)模假設(shè)生成技術(shù)帶入細(xì)胞生物學(xué)和組織生物學(xué)的一組方法——這將奠定思維和技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)。研究人員將能夠在空間環(huán)境中對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行細(xì)致研究，并進(jìn)行其他測(cè)量，例如酶促過(guò)程和細(xì)胞之間、基因之間和蛋白質(zhì)之間的相互作用。他們將能夠?qū)臻g中感興趣的方面進(jìn)行編碼和錨定，這將改變細(xì)胞生物學(xué)以及病理學(xué)和組織學(xué)的實(shí)踐方式。

Zeng看到了許多未來(lái)的機(jī)會(huì)。在很多情況下，這些技術(shù)并不完美，我們想要更多更好的東西，以擴(kuò)大技術(shù)并能夠常規(guī)有效地測(cè)量數(shù)千個(gè)基因。Tasic 說(shuō)，空間方法將成為標(biāo)準(zhǔn)?？傆幸惶烊藗儠?huì)從組織取回空間解析的單細(xì)胞遺傳信息，對(duì)該領(lǐng)域論文的常見(jiàn)反應(yīng)可能會(huì)變成：“哦，你沒(méi)有測(cè)量所有基因？為什么不？”