Science亮點(diǎn)！ExSeq：完整生物組織的原位空間轉(zhuǎn)錄組分析
背 景 介 紹
新一代測(cè)序技術(shù)的革新使得我們對(duì)生物體的組學(xué)信息有了更深的了解，隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的日漸普及，尤其是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的突飛猛進(jìn)，使得我們對(duì)組織內(nèi)細(xì)胞異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)有了很大提升，另外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在鑒定新型細(xì)胞亞群層面更是具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但是，無(wú)論是傳統(tǒng)常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，還是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，都是以犧牲空間信息為代價(jià)的。
空間位置信息對(duì)組織內(nèi)細(xì)胞命運(yùn)選擇、胚胎發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面具有不可忽略的作用。因此，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。當(dāng)前，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)無(wú)論在技術(shù)開(kāi)發(fā)，還是大規(guī)模的應(yīng)用和商業(yè)化，都得到了蓬勃發(fā)展，更是被Nature Methods評(píng)為年度方法，這也預(yù)示著該技術(shù)有可能引領(lǐng)下一個(gè)研究熱潮。
另外，繪制轉(zhuǎn)錄本的亞細(xì)胞位置對(duì)于理解不同的生物學(xué)過(guò)程也很重要，但是，在細(xì)胞中對(duì)轉(zhuǎn)錄本的成像以及更細(xì)節(jié)的細(xì)胞形態(tài)的分析則需要依賴納米級(jí)別的精分辨率，想要達(dá)到如此高的分辨率并非易事。即使是能夠進(jìn)行高分辨率RNA分子成像的seqFISH+（Sequential fluorescence in situ hybridization）技術(shù)也不能解決達(dá)到納米級(jí)精度這一難題。
為此，來(lái)自MIT、哈佛醫(yī)學(xué)院等單位的科學(xué)家合作開(kāi)發(fā)了一種被稱之為擴(kuò)展測(cè)序（expansion sequencing, ExSeq）的技術(shù)方法，并以“Expansion sequencing: Spatially precise in situ transcriptomics in intact biological systems”為題發(fā)表在Science上。該技術(shù)提供了一個(gè)獨(dú)特的方法，可以了解哪些基因在細(xì)胞的哪些部位表達(dá)，并可以讓研究者們更多地了解基因表達(dá)如何受到細(xì)胞位置或其與附近細(xì)胞相互作用的影響。
主 要 內(nèi) 容
擴(kuò)展測(cè)序是將組織擴(kuò)展和原位RNA測(cè)序結(jié)合起來(lái)的一種新型技術(shù)。組織擴(kuò)展技術(shù)是通過(guò)將吸水聚合物嵌入組織樣本中，在保持其整體結(jié)構(gòu)完整性的同時(shí)使組織樣本膨脹。借助這種方法，組織可以膨脹100倍之多，這使得研究人員可以使用普通的光學(xué)顯微鏡就可以獲得非常高分辨率的圖像信息。原位RNA測(cè)序技術(shù)則可以對(duì)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)皿里生長(zhǎng)的細(xì)胞中對(duì)數(shù)千個(gè)mRNA分子進(jìn)行定位和測(cè)序。
具體來(lái)講，擴(kuò)展測(cè)序技術(shù)的主要步驟如下：（I）樣本固定，將RNA方法分子與Anchor結(jié)合；（II）將樣品嵌入可膨脹的凝膠材料中；（III）將RNA分子錨定在凝膠材料之中；（IV）使用RISSEQ技術(shù)對(duì)RNA分子進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增；（V）原位測(cè)序。同時(shí)，在原位測(cè)序結(jié)束后，這些納米孔中的cDNA被回收送去二代測(cè)序，測(cè)序結(jié)果會(huì)與原位測(cè)序的結(jié)果關(guān)聯(lián)結(jié)合起來(lái)。這種技術(shù)可以使得全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組信息及其空間位置都能夠得到解讀，同時(shí)，較長(zhǎng)的測(cè)序讀長(zhǎng)還可以實(shí)現(xiàn)剪切體的檢測(cè)，并且這種非靶向的測(cè)序還會(huì)無(wú)偏頗的捕捉轉(zhuǎn)錄組信息，意味著研究人員不是在尋找特定的RNA序列，而是可以發(fā)現(xiàn)成千上萬(wàn)種不同序列。
為了驗(yàn)證擴(kuò)展測(cè)序的有效性，研究者們分別建立了非靶向和靶向的兩種技術(shù)方法。其中，通過(guò)使用非靶向擴(kuò)展測(cè)序技術(shù)，他們對(duì)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突中存在的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了解讀，包括其中滯留的內(nèi)含子、轉(zhuǎn)錄因子以及長(zhǎng)非編碼RNAs。結(jié)果表明，樹(shù)突中存在含有內(nèi)含子的mRNA，同時(shí)也存在編碼轉(zhuǎn)錄因子的mRNA分子，這一發(fā)現(xiàn)表明了樹(shù)突可能存在溝通細(xì)胞核的新形式。
除此之外，研究人員還借助靶向擴(kuò)展測(cè)序技術(shù)，對(duì)小鼠視覺(jué)皮層中層與層之間特異性的細(xì)胞類型進(jìn)行解析，并對(duì)海馬椎體神經(jīng)元間隔中的RNA進(jìn)行分析。研究人員發(fā)現(xiàn)，棘突中的mRNA分布與相鄰的樹(shù)突是不同的。另外，他們還發(fā)現(xiàn)不同類型海馬區(qū)神經(jīng)元中RNA樹(shù)突狀結(jié)構(gòu)之間的分布具有相似的模式。
最后，他們還對(duì)人類轉(zhuǎn)移性乳腺癌活檢樣品進(jìn)行擴(kuò)展測(cè)序，借助該技術(shù)繪制了存在不同細(xì)胞類型表達(dá)不同基因的圖譜，這一圖譜可以作為識(shí)別不同類型細(xì)胞以及不同細(xì)胞之間互作的重要參考信息。同時(shí)，分析結(jié)果也顯示，這些細(xì)胞類型會(huì)因?yàn)樗鼈?strong>在腫瘤內(nèi)位置的不同而作出不同的表現(xiàn)。比如，某些炎癥基因更高水平地表達(dá)在靠近腫瘤細(xì)胞的B細(xì)胞。
總的來(lái)說(shuō)，擴(kuò)展測(cè)序可以在完整的細(xì)胞和組織中實(shí)現(xiàn)從納米尺度到系統(tǒng)尺度的轉(zhuǎn)錄本多通道分析，其在胚胎發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)等研究方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，這一技術(shù)也為癌癥中細(xì)胞相互作用的研究提供了重要工具，為未來(lái)研發(fā)更加有效的治療方法提供了理論基礎(chǔ)。
文章共同通訊作者、麻省理工學(xué)院神經(jīng)技術(shù)學(xué)教授Ed Boyden說(shuō)：“基因表達(dá)是所有生物學(xué)中最基本的過(guò)程之一，它在所有健康和疾病相關(guān)的生物過(guò)程中發(fā)揮作用。然而，你需要知道的不僅僅是基因是否開(kāi)啟或關(guān)閉，你想知道基因產(chǎn)物的位置。你關(guān)心的是它們屬于哪種細(xì)胞類型，它們?cè)谀膫€(gè)細(xì)胞中起作用，甚至它們?cè)诩?xì)胞的哪個(gè)部分起作用?！?/span>
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